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目的他汀类药物作为临床一线用药,对降低动脉粥样硬化性心脑血管疾病的发生率和死亡率发挥了重要作用。但在降血脂的同时提高了血浆中前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convrtase subtilisin/kexin type 9,PCSK9）的水平,而PCSK9下调细胞膜上低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor,LDLR）的表达,一定程度上削弱了他汀类药物的降血脂效应。本课题组前期研究发现货运受体Surf4（Cargo Receptor Surf4）能够促进PCSK9的分泌,提示他汀类药物可能是通过Surf4介导PCSK9分泌,迄今未见文献证实。故本研究以载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠为动物模型,借助于基因干扰技术,分别从整体和细胞水平干扰Surf4,观察洛伐他汀对血浆中胆固醇及PCSK9水平的影响;检测洛伐他汀对肝组织中Surf4、PCSK9、LDLR及内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress,ERS）相关蛋白表达水平的影响。另外,以HepG2为细胞模型,干扰Surf4,分析洛伐他汀促进PCSK9分泌的可能分子机制。方法1.构建干扰Surf4的腺病毒载体首先将AAV-H1-SV40腺病毒载体酶切后,插入设计的干扰Surf4的基因片段,然后将重组的腺病毒载体质粒与Phelper质粒、DJ/8质粒混合后转染到HEK293细胞,腺病毒包装完成后,收集转染的HEK293细胞,裂解细胞,纯化病毒,进行滴度测定。2.动物实验将ApoE-/-小鼠32只,随机分为4组:对照组（Con）、洛伐他汀组（Lov）、阴性干扰+洛伐他汀组（si-NC+Lov）、Surf4干扰+洛伐他汀组（si-Surf4+Lov）,高脂饮食喂养,内眦注射Surf4或阴性干扰病毒(1.0×1010GC/μl),Con及Lov组注射等量生理盐水;后加药组灌胃洛伐他汀混悬液（2.6mg/kg/d）,对照组灌胃相同体积的生理盐水。分别在AAV注射前取一次血、注射后每隔10d取一次（标记为:10d、20d、30d、40d、60d）,最后60d处死动物并取材。利用试剂盒检测小鼠血浆中胆固醇及PCSK9的水平;实时荧光定量PCR法检测小鼠肝脏组织中PCSK9和Surf4 mRNA的表达;Western blot法检测小鼠肝脏组织中Surf4、PCSK9、LDLR及ERS相关蛋白的表达水平。3.细胞实验首先利用HepG2细胞,将洛伐他汀设置不同浓度梯度（0μmol/L、0.625μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L）,药物处理24h。观察在HepG2细胞内洛伐他汀对PCSK9蛋白表达的影响。用钙离子荧光探针法,观察干扰Surf4对胞内钙离子荧光强度的影响。观察PKA抑制剂对洛伐他汀诱导的HepG2细胞ERK1/2磷酸化水平及PCSK9蛋白表达的影响。将HepG2细胞分为4组:对照组（Con）、洛伐他汀组（Lov）、阴性干扰+洛伐他汀组（si-NC+Lov）、Surf4干扰+洛伐他汀组（si-Surf4+Lov）,利用Western blot法检测细胞蛋白中Surf4、PCSK9、LDLR及ERS等相关蛋白的表达。结果1.干扰Surf4腺病毒转染效率及滴度结果腺病毒转染48h左右后,在倒置荧光显微镜下观察人胚胎肾细胞中绿色荧光情况,结果发现阴性腺病毒转染组（si-NC）和干扰Surf4腺病毒转染组（si-Surf4）的细胞绿色荧光均能够达到70%80%,表明成功构建了干扰Surf4腺病毒,其中阴性腺病毒（si-NC）的滴度为1.149×108GC/μl,干扰Surf4腺病毒（si-Surf4）的滴度为1.097×109GC/μl。2.干扰Surf4减弱洛伐他汀对ApoE-/-小鼠血浆中胆固醇及PCSK9水平的影响结果显示,在第10d、20d、30d、40d、60d,Lov组血浆中胆固醇的水平显著低于Con组,而PCSK9的水平则显著高于Con组（P<0.05）;Lov组和si-NC+Lov组相比,血浆中胆固醇和PCSK9的水平无显著变化（P>0.05）;与Lov组相比较,si-Surf4+Lov组血浆中胆固醇和PCSK9的水平均显著降低（P<0.05）。3.干扰Surf4对洛伐他汀诱导的ApoE-/-小鼠肝脏中Surf4、PCSK9及LDLR表达的影响与Con组相比较,Lov组肝脏组织中Surf4和PCSK9的mRNA及蛋白表达水平显著升高（P<0.05）,而LDLR的蛋白表达水平无显著的统计学意义（P>0.05）;si-Surf4+Lov组肝组织中Surf4和PCSK9的mRNA及蛋白表达水平较Lov组则显著降低（P<0.05）,LDLR的蛋白表达水平则显著升高（P<0.05）。4.干扰Surf4对洛伐他汀诱导的ApoE-/-小鼠肝脏中ERS相关蛋白（ATF-6、p-PERK、GRP78、p-EIF2α）表达的影响与Con相比,Lov组中ATF-6、GRP78蛋白的表达显著提高,同样p-PERK、p-EIF2α的蛋白表达也升高（P<0.05）;而与Lov相比,干扰Surf4能够降低洛伐他汀诱导的ATF-6、GRP78的蛋白表达以及p-PERK和p-EIF2α的蛋白表达水平,差异显著（P<0.05）。5.洛伐他汀对HepG2细胞中PCSK9蛋白表达水平的影响不同浓度的洛伐他汀组（0.625μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L）与0μmol/L相比,PCSK9的表达都上调,其中2.5μmol/L洛伐他汀上调PCSK9的作用最明显（P<0.001）。6.干扰Surf4对洛伐他汀诱导的HepG2细胞Surf4、PCSK9及LDLR蛋白表达的影响与Con组相比较,Lov组中Surf4蛋白和PCSK9蛋白的表达都有所提高（P<0.05）,LDLR的表达也上升,但差异没有统计学意义（P>0.05）;与Lov组相比,si-Surf4+Lov组中Surf4蛋白和PCSK9蛋白的表达显著下降（P<0.05）,LDLR的蛋白表达水平显著提高（P<0.05）。7.干扰Surf4对洛伐他汀诱导的HepG2细胞ERS相关蛋白（ATF-6、p-PERK、GRP78、p-EIF2α）表达的影响与Con组相比较,Lov组中内质网应激蛋白的表达水平均升高,差异明显（P<0.05）;与Lov组相比较,干扰Surf4能够减弱洛伐他汀诱导的内质网应激蛋白的蛋白表达水平（P<0.05）,差异明显,有统计学意义。8.干扰Surf4对洛伐他汀诱导的HepG2细胞ERK1/2磷酸化水平及PKA、SREBP2蛋白表达水平的影响与Con组相比较,Lov组ERK1/2的磷酸化水平及PKA、SREBP2的蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）;同Lov组相比较,干扰Surf4能够显著抑制ERK1/2的磷酸化水平及PKA、SREBP2的蛋白表达水平（P<0.05）。9.PKA可能参与了洛伐他汀诱导的HepG2细胞ERK1/2磷酸化水平及PCSK9蛋白表达的过程与Con组相比较,Lov组ERK1/2的磷酸化水平及PCSK9的蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）;与Lov组相比,抑制PKA后能够显著降低ERK1/2的磷酸化水平及PCSK9蛋白表达水平（P<0.05）。10.干扰Surf4增强HepG2细胞胞内钙的荧光强度结果显示,si-Surf4组细胞内Ca2+的绿色荧光强度明显较Con组显著增强。结论1.干扰Surf4能够抑制洛伐他汀诱导的ApoE-/-小鼠肝脏PCSK9的蛋白表达。2.洛伐他汀促进PCSK9的合成可能是通过诱导Surf4的表达,引起肝细胞钙耗竭,激活ERS-PKA-ERK1/2-SREBP2信号通路来实现的。