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目的：乳腺癌的发生并不仅仅与乳腺上皮细胞的病变有关，不同年龄阶段的乳腺细胞处于不同的微环境中，其发病机制有所不同。但是现有的体外衰老研究模型都重点探讨乳腺细胞发生衰老会产生的影响，并没有明确地说明乳腺衰老微环境对乳腺细胞的影响，以及是否与乳腺癌发生发展密切相关。同时，现有的体内衰老模型中，大多采用衰老的小鼠模型作为体内实验的主要对象，然而其实验周期长，外在影响因素多，影响实验进程。另外，大量研究已经证明，微环境对肿瘤细胞增殖生长以及侵袭转移的重要性，那么，在体外研究乳腺癌的病理机制性问题时，如果单纯地探讨乳腺细胞以及乳腺癌细胞，则会使得实验结果与体内的乳腺细胞生理微环境下的病理反应有所出入，并不能完全地代表体内真实的病理机制。多项研究表明，小窝蛋白1（Cav1）与肿瘤发生关系密切，在体内，基质Cav1重建癌旁和癌内的微环境来促进肿瘤的侵袭和转移能力，并抑制细胞凋亡。因而本实验室拟将建立体外的乳腺细胞衰老致癌模型，将正常的小鼠胚胎成纤维细胞Cav1基因敲除，然后与乳腺细胞进行3D体外共培养，建立一个体外的衰老致癌的微环境模型，为今后的体外研究实验尽可能地模拟人体内生理微环境，从而为各种疾病的研究和治疗提供更加有效的证据。 方法：首先选用不同的乳腺癌细胞系（MCF7和MDA-MB-231-GFP）、不同年龄 C57/GFP小鼠乳腺细胞以及人类女性乳腺细胞与正常成纤维细胞或者Cav1-KO成纤维细胞分别进行3D体外共培养，分为：Cell3D组、+3T3组和+Cav1-KO组，培养15天后观察测量形成的3D结构的形态、大小和个数；其次将3D结构进行石蜡包埋后切片做免疫组织化学Ki67、p53、p63、γH2A.X、CK8、CK14等抗体染色；接着采用软琼脂集落形成实验（Soft Agar Assay），验证不同分组处理的乳腺细胞侵袭性和迁移性；最后将体外共培养形成的3D结构再次消化形成单细胞悬液后，采用不同的细胞表面标志物（ABCG2、CD201、CD24、CD44、CD49f、ALDH等抗体）进行流式细胞分选分析，确定乳腺干细胞以及乳腺癌干细胞的比例变化。 结果：NIH-3T3和Cav1-KO成纤维细胞都能够促进乳腺细胞3D形成率的增加，同时 Cav1-KO成纤维细胞明显对年轻乳腺细胞、良性乳腺细胞以及癌细胞的3D形成率影响更大，而且3D形态差异较大，+Cav1-KO组花样结构的3D形成率增高；Ki67抗体IHC结果表示，Cav1-KO成纤维细胞能显著性地促进3D结构中乳腺细胞增殖。CK8和CK14 IHC结果显示，Cav1-KO成纤维细胞抑制CK8和CK14在3D结构细胞中的表达；并且，Cav1-KO明显影响乳腺细胞核的形态，使之出现体积膨大、染色质固缩和断裂等衰老特征，结合γH2A.X和p53、p63等抗体IHC结果，以及Annexin V和7AAD等流式细胞分析，验证了Cav1-KO成纤维细胞确实促使乳腺细胞恶性增殖，促进细胞凋亡，产生衰老和癌前病变特性，同时正常的成纤维细胞抑制乳腺细胞凋亡。软琼脂集落形成实验结果显示，Cav1-KO成纤维细胞增强乳腺细胞集落形成率，以及微触须结构平均长度，ABCG2、CD201、CD24、CD44、CD49f、ALDH等乳腺癌干细胞标志性抗体流式细胞分析实验，结果显示 Cav1-KO成纤维细胞显著性增高乳腺癌干细胞的比例，并且正常成纤维细胞明显地降低乳腺癌干细胞的比例。 结论：Cav1-KO成纤维细胞增强乳腺细胞基因损伤累积，激活DNA损伤反应，磷酸化H2A.X蛋白，启动p53信号通路，促进细胞凋亡和增殖反应，尤其影响年轻乳腺管腔上皮祖细胞的生物学活性，导致其分化恶变形成乳腺癌干细胞，增强乳腺细胞增殖能力，促进其侵袭性和迁移性，最终导致正常乳腺细胞发生衰老和癌前病变。与此相反，正常成纤维细胞能够抑制乳腺细胞的恶性增殖，减少细胞凋亡，并降低乳腺细胞的基因损伤累积。该结论证明，微环境作为一把双刃剑，可以为乳腺癌的治疗提供有力的依据。综上所述：本实验乳腺癌体外衰老致癌模型可以应用于正常细胞的敏感性筛选，癌症治疗药物的筛选，以及体内成瘤实验等的前期药物敏感性处理优化等，为乳腺癌体外研究提供尽可能的体内生理环境，对进一步研究探讨更加精确的乳腺癌发病机制具有重大意义。