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亨廷顿蛋白相关蛋白1(Huntingtin-associated protein1，HAP1)因与亨廷顿病(Huntingtons disease，HD)基因产物亨廷顿蛋白(huntingtin，Htt)的相互作用而受到关注。研究表明，HAP1广泛分布在神经系统，以在下丘脑的表达水平最高。内分泌细胞在很多方面与神经元相似，原位杂交研究显示，垂体、生殖腺中有HAP1mRNA表达，肾上腺髓质嗜铬细胞的瘤细胞系PC12细胞表达高水平的HAP1，然而，至今未见内分泌系统是否表达HAP1的系统研究。下丘脑是内分泌系统的调节中枢，下丘脑许多神经元具有内分泌功能，HAP1在下丘脑内的高水平表达提示HAP1可能与内分泌功能有关，但目前也未见下丘脑中HAP1功能的报道。有研究初步表明，HAP1与神经细胞内的物质运输有关，但缺乏直接的证据。本研究综合应用细胞与分子生物学技术，在明确HAP1是否在内分泌系统中表达的基础上，对下丘脑和内分泌系统中HAP1的功能进行了初步探讨。 一、HAP1在大鼠内分泌系统中的免疫组织化学定位 以前的研究提示，内分泌系统可能有HAP1表达，但一直没有免疫组织化学研究资料予以证实。本部分应用免疫组织化学技术观察了HAP1在内分泌系统的分布，并对其中表达HAP1的细胞的种类进行了分析。应用免疫组织化学ABC法观察到，HAP1免疫反应阳性细胞广泛分布在垂体前叶，散布于甲状腺滤泡细胞之间或者呈束分布在甲状腺滤泡之间，选择性分布在肾上腺髓质和胰岛中，而肾上腺皮质和胰腺外分泌部无HAP1表达;此外，HAP1阳性细胞还散在分布在胃和小肠粘膜，其分布模式和胃肠内分泌细胞相似;神经垂体内未见HAP1免疫反应阳性细胞，但有很多呈HAP1免疫阳性的stigmoid小体，这种HAP1免疫阳性的stigmoid小体也见于腺垂体前叶、甲状腺、肾上腺髓质、胰岛、胃肠粘膜HAP1阳性细胞胞质中;睾丸和卵巢内未见HAP1免疫阳性反应细胞。免疫荧光双标显示，垂体前叶可见大量HAP1-促甲状腺激素双标细胞，但未见HAP1-生长激素、HAP1-促肾上腺皮质激素双标细胞;甲状腺中HAP1阳性细胞几乎都呈生长抑素免疫反应阳性;胰岛中HAP1阳性细胞几乎都呈胰岛素免疫反应阳性，但未见HAP1-胰高血糖素和HAP1-生长抑素双标细胞;胃幽门和小肠内可见大量HAP1-胃泌素双标细胞，但未见HAP1-生长抑素双标细胞。上述结果表明，HAP1选择性表达于内分泌系统分泌含氮类激素的内分泌细胞中。鉴于HAP1与神经细胞内的物质运输有关，HAP1在具有内分泌颗粒的分泌含氮类激素的内分泌细胞中的选择性表达提示，HAP1可能和内分泌颗粒和/或相关激素分子的转运和分泌有关。 二、肾上腺皮质激素对大鼠下丘脑HAP1表达的影响 HAP1在下丘脑众多核团具有高水平表达，但HAP1在下丘脑的功能目前尚不明确。为了了解HAP1是否参与下丘脑神经元或神经内分泌细胞的活动，本部分在证明HAP1是否存在于下丘脑促皮质激素释放激素(corticotrophin-releasing hormone，CRH)细胞的基础上，观察了糖皮质激素对下丘脑HAP1表达的影响。双标免疫荧光研究显示，下丘脑含有较多的HAP1-CRH双标细胞。免疫印迹研究显示，下丘脑HAP1在大鼠注射皮质酮后第1d和第3d显著减少，第5d开始回升，第7d恢复到正常水平;给予皮质酮注射的同时注射糖皮质激素受体拮抗剂RU38486，可消除皮质酮注射对下丘脑HAP1的影响。应用RT-PCR检测显示，注射皮质酮后，大鼠下丘脑HAP1 mRNA表达水平的变化与HAP1表达水平的变化基本一致，即在皮质酮注射后第1d和第3d下降，第5d和7d升高。在动物的饮用水中加入氢化可的松，一个月以后用western blot检测下丘脑HAP1的变化，结果发现长期饮用氢化可的松的大鼠下丘脑HAP1明显降低。HAP1与CRH在下丘脑同一神经元内的共存提示，HAP1可能与CRH具有相互作用，参与调节CRH的合成、运输或分泌;糖皮质激素注射能明显影响下丘脑内HAP1的表达表明，HAP1参与下丘脑神经元或神经内分泌细胞的功能活动;糖皮质激素注射使下丘脑HAP1 mRNA表达也明显降低，表明过量的糖皮质激素通过负反馈作用抑制下丘脑CRH等细胞功能的同时也能直接或间接地抑制HAP1表达。HAP1表达的降低也可能与其参与下丘脑神经元或神经内分泌细胞的功能活动而被大量消耗或代谢有关。 三、寒冷应激对大鼠肾上腺髓质HHAP1表达的影响 第一部分工作曾证明，HAP1大量存在于肾上腺髓质细胞内。肾上腺髓质细胞包括肾上腺素细胞和去甲肾上腺素细胞，其分泌活动受交感神经节前纤维的控制，应激等因素可兴奋交感神经而促进肾上腺髓质细胞的分泌。为了证明HAP1是否参与肾上腺髓质细胞的功能活动，本部分在明确HAP1在肾上腺髓质细胞的超微结构定位特征的基础上，观察了寒冷对大鼠肾上腺髓质内HAP1表达的影响。免疫电镜研究观察到，HAP1除定位在肾上腺髓质细胞内粗面内质网上外，还定位于髓质细胞分泌颗粒外膜上，与分泌颗粒关系非常密切。Western blot检测发现，受到寒冷刺激(4℃)12h的大鼠髓质内，HAP1明显下降，约为对照组的10％;免疫组织化学检测显示，髓质细胞HAP1免疫反应阳性细胞数量减少，免疫反应产物光密度明显降低。HAP1定位于髓质细胞分泌颗粒提示HAP1与肾上腺髓质细胞内肾上腺素和/或去甲肾上腺素的合成、运输和/或分泌有关;寒冷应激使髓质内HAP1表达减少表明HAP1参与肾上腺髓质细胞的功能活动，寒冷应激可能通过促进了HAP1的活动而使其大量消耗或代谢，但寒冷应激抑制HAP1的表达可能性不能排除。 四、HAP1与PC12细胞内囊泡动力学关系的全内反射荧光显微镜研究 物质转运在维持神经元的正常功能中具有重要作用。已有研究认为，HAP1参与神经元内物质的顺行和逆行运输，与细胞内物质转运有关;HAP1能和GABAA受体、IP3受体1结合，与细胞膜受体的胞吞有关。神经元突触囊泡上含有HAP1，肾上腺髓质细胞的内分泌颗粒上也有HAP1存在，本研究第二和第三部分也表明HAP1参与神经元或神经内分泌细胞和内分泌细胞的功能活动，但HAP1是否与突触囊泡或内分泌颗粒的运输有关，目前未见报道。为了阐明HAP1与突触囊泡或内分泌颗粒运输的关系，本部分以PC12细胞内的类突触小囊泡(Synaptic vesicle-likemicrovesicle， SLMV)和致密核心大囊泡(Large dense cored vesicle，LDCV)为模型，利用全内反射荧光显微镜(Total internal reflection fluorescence microscopy，TIRFM)技术，观察了以小分子干扰RNA(siRNA)技术沉默HAP1后PC12细胞内2种囊泡动力学的变化。针对靶基因HAP1，设计靶点特异性的siRNA，将其插入带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)的表达载体Pgenesil-1，构建HAP1 siRNA干扰质粒Pgenesil-LM1。将红色荧光蛋白突变体2(Discosoma sp.red fluorescent protein variant2，DsRed2)基因与囊泡乙酰胆碱转运载体(Vesicular acetylcholine transporter，VAChT)cDNA重组标记PC12细胞的SLMV，DsRed2基因和神经肽Y(Neuropeptide Y，NPY)cDNA重组标记PC12细胞的LDCV。激光共聚焦显微镜和TIRFM成像观察显示，Pgenesil-LM1能够有效抑制HAP1的表达，NPY-DsReD2和VAChT-DsReD2正确标记了大、小囊泡。TIRFM观察发现，干扰HAP1的表达能明显抑制PC12细胞内致密核心大囊泡的扩散系数(Diffusioncoefficient)以及平均方差位移(Mean squared displacement，MSD)，但对类突触小囊泡的扩散系数和MSD没有影响。研究结果表明，HAP1与致密核心大囊泡的运动有关，HAP1可能参与肽能神经元或神经内分泌细胞及分泌含氮类激素的内分泌细胞的致密核心大囊泡的运输。