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研究背景：结直肠癌是我国最常见的、对人类健康危害最大的恶性肿瘤之一。近年来,随着人们生活水平的提高,生活习惯的改变,结直肠癌的发病率逐年上升。结直肠癌根治术治疗效果显著,但由于癌组织在早期已经发生侵袭和转移,它仍然对患者的生命健康具有极大威胁。因此,探讨结直肠癌发生及转移的机制,仍是肿瘤学的迫切任务。甲基化是真核细胞中DNA正常的修饰方式。在正常发育的早期阶段,甲基化和去甲基化的交替进行是细胞得以生长和分化的关键程序,在保持细胞基因组稳定性中甲基化也起着至关重要的作用。同时发现,在许多人类肿瘤中也有不同程度的DNA异常甲基化现象。启动子区CpG岛发生异常高甲基化可导致基因转录沉默,使抑癌基因、细胞周期调节基因、凋亡基因等表达极度降低或不表达,参与肿瘤的发生发展。在许多恶性肿瘤的癌前病变中发现了多个抑癌基因的CpG岛高甲基化。这说明,启动子区CpG岛高甲基化在肿瘤的早期阶段已存在。DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)是DNA甲基化发生、完成、持续的重要作用酶。目前发现的DNA甲基化转移酶主要有四种即DnmT1、 DnmT2、DnmT3a、DnmT3b。研究表明,DNMT1主要作用是对新合成的DNA链进行甲基化修饰并维持,在乳腺癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤中均表达异常增高,并与肿瘤的分化程度、临床分期或(和)预后不良有不同程度的相关性。DNMT1过表达会导致多种基因启动子区域CpG岛甲基化。近年来微小RNA (microRNA, miRNA)逐渐被研究者重视,成为肿瘤研究的热点。miRNA是真核生物细胞中一类长度约为18-24核苷酸的内源性非编码小分子RNA。它由DNA转录产生,但并不翻译蛋白质,而是在蛋白质合成中起调节其他基因的功能,是调控其他蛋白质编码基因的基因。它通过非特异性结合位点的作用,可以对多个基因经行一对多、多对一的调控作用。因此,对miRNA特别是成家族的miRNA的检测较之单个基因的检测,在肿瘤的烟酒及之中更具前瞻性意义。miR-200家族是近年来研究的热点, miR-200a作为miR-200家族(包括miR-200a, miR-200b, miR-200c,miR-114,miR-429)的一员在多种肿瘤中表达下调,主要通过调控上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)过程,对肿瘤的侵袭、转移起关键作用。本课题组在前期的工作中对miR-200a在结直肠癌新鲜组织中的表达进行了小样本量的检测。检测结果表明,miR-200a的表达与结直肠癌的分化程度具有相关性。在结直肠癌细胞中的检测表明miR-200a可以调控细胞的EMT现象。在前期工作的基础上,为了深入了解miR-200a在结直肠癌侵袭转移的分子机制,探寻miR-200家族启动子区域甲基化与结直肠癌浸润转移之间的关系,拟进一步进行如下研究。研究内容：1.检测HCT116、HT29、LS174t、SW480、SW620、Lovo这6株细胞中miR-200家族启动子甲基化状态,分析其与临床分期、分化程度及预后的相关性；同时进行miR-200家族甲基化程度与患者生存相关与分析；2.对HCT116、HT29细胞使用抑制miR-200a处理,对SW620、Lovo细胞使用过表达miR-200a处理,检测miR-200a表达量改变对细胞运动转移能力和DNMT1表达的影响；3.对HCT116、HT29细胞使用抑制miR-200a处理,激活TGF-β通路处理,对SW620、Lovo细胞使用过表达miR-200a处理,抑制ERK通路,通过免疫印迹方法检测通路中标志物TβRⅡ、p-ERK表达量,探讨miR-200a对DNMT1调控的作用机制。4.在HCT116、HT29、SW620和Lovo四株细胞中分别下调和上调miR-200a,检测TGF-β1表达量,并通过生物信息学分析,寻找miR-200a与TGF-β通路可能存在的调控靶点。结果：1.BSP方法检测结果显示,六株不同恶性程度的结直肠癌细胞株中miR-200家族启动子甲基化程度不同,并且其甲基化程度与细胞恶性程度成反比,与细胞株中miR-200a表达量的检测结果一致。MSP方法检测显示,在138例结直肠癌组织中miR-200家族启动子甲基化程度与患者年龄无关,与患者性别(F=6.834,P=0.033)、肿瘤最大直径(F=11.310,P=0.003)、淋巴结及远处转移(F=23.929,P=0.000)及患者术后生存时间相关(F=53.598,P=0.000)；完全甲基化病例三年生存率明显低于未甲基化和部分甲基化病例(x2=8.967,P=0.01),未甲基化和部分甲基化病例之间无明显差异(P>0.05)：完全甲基化病例五年生存率明显低于未甲基化和部分甲基化病例(x2=24.934,P=0.000),部分甲基化病例低于未甲基化病例(x2=18.271,P=0.000)。2.对miR-200a高表达的HT29和HCT116细胞进行miR-200a的抑制后,实时荧光定量PCR检测48h抑制效率分别约为50.9%和54.4%。实时荧光定量PCR检测结果显示,HT29和HCT116细胞的下调miR-200a组在mRNA水平DNMT1表达显著升高(F=38.278,P=0.000)(F=21.433,P=0.002);Western Blot实验结果显示,HT29和HCT116细胞的下调miR-200a组的DNMT1在蛋白水平表达量显著升高。划痕实验显示,HT29和HCT116细胞的下调miR-200a组的迁移能力较对照组显著增强；Transwell小室细胞运动实验结果显示,HT29和HCT116细胞的下调miR-200a组穿膜数量较对照组显著增多(t=-6.051,P=0.004)(t=8.537,P=0.001)。3.对miR-200a低表达的SW620和Lovo细胞进行miR-200a的过表达后,实时荧光定量PCR检测48h miR-200a/mimics组表达倍数为negative control组2053倍和1020倍。实时荧光定量PCR检测结果显示,SW620和LoVo细胞的上调miR-200a组在mRNA水平DNMT1表达显著下降(F=19.221,P=0.005)(F=29.498,P=0.000)；Western Blot实验结果显示,SW620和LoVo细胞的上调miR-200a组的DNMT1在蛋白水平表达量显著降低。划痕实验显示,SW620和LoVo细胞的上调miR-200a组的迁移能力较阴性对照组显著减弱。Transwell小室细胞运动实验结果显示,SW620和LoVo细胞的上调miR-200a组的穿膜数量较对照组显著减少(t=-64.048,P=0.000)(t=-56.402,P=0.000)。4.对HCT116和HT29细胞进行TGF-β1激活TGF-β通路处理,对SW620和LoVo细胞进行U0126抑制ERK通路处理。通过免疫印迹方法检测通路中标志物表达量。结果显示：TGF-β诱导组的TβRⅡ、p-ERK1/2表达量比其空白表达增强；在SW620和Lovo细胞中,U0126抑制组的p-ERK1/2表达量比其空白组表达减弱,而TβRⅡ表达量没有变化。5.在HCT116、HT29、SW620和Lovo四株细胞中分别下调和上调miR-200a,检测TGF-β1表达量。结果显示：四株细胞的实验组与对照组的TGF-β1表达量差异不具有统计学意义(p>0.05)。6.通过软件http://www.targetscan.or预测到TGF-β亚型中的TGF-β2与miR-200a存在两个8bp的结合位点。miR-200a可能通过这两个结合位点实现对TGF-β通路的调控。结论：1.miR-200家族的表达受到甲基化修饰的调控,并且此调控成为影响表达量的主要原因。miR-200家族启动子区域甲基化与患者年龄不具相关性,与患者性别,肿瘤大小,是否发生转移以及预后具有相关性。2.miR-200家族甲基化程度与结直肠癌患者生存期密切相关,可以作为预后指标。3.结直肠癌细胞株中miR-200a表达量降低促使癌细胞的运动转移能力增强,基因组甲基化能力增强。4.结直肠癌细胞株中miR-200a表达量升高促使癌细胞的运动转移能力减弱,基因组甲基化能力减弱。5. miR-200a可以通过TGF-β—ERK通路实现对DNMT1的调控。