【摘 要】
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生产用枯草芽孢杆菌在长期反复活化培养过程中会出现活力下降,需变更活化培养条件以复壮菌株。不同的菌种都有其各自不同的最适培养条件,改变其中任何一种条件,都会对菌种的生长、繁殖带来一定影响,所以在菌种培养过程中,要尽可能提供菌种所需要的最适生长条件,减少菌种退化的几率。本研究根据企业生产需要,研究建立了一株活力下降芽孢杆菌的复壮培养条件,并用模式动物小鼠评估了复壮菌株的益生潜力,结果如下:1.发酵培养
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生产用枯草芽孢杆菌在长期反复活化培养过程中会出现活力下降,需变更活化培养条件以复壮菌株。不同的菌种都有其各自不同的最适培养条件,改变其中任何一种条件,都会对菌种的生长、繁殖带来一定影响,所以在菌种培养过程中,要尽可能提供菌种所需要的最适生长条件,减少菌种退化的几率。本研究根据企业生产需要,研究建立了一株活力下降芽孢杆菌的复壮培养条件,并用模式动物小鼠评估了复壮菌株的益生潜力,结果如下:1.发酵培养条件建立从企业保存的12株产量退化的枯草芽孢杆菌中筛选出1株产蛋白酶含量相对较高、发酵液活菌数最多的枯草芽孢杆菌JB286,通过单因素试验与正交试验相结合,建立适合JB286菌株的最适摇瓶培养条件及发酵体系:初始p H 7.2,转速160 rpm,培养温度37°C,接种量6%～8%,装液量20%;最佳培养基配比为:蛋白胨4%,葡萄糖2%,氯化钠5%,玉米粉5%,豆粕4%,酵母粉5%,硫酸锰1%;摇瓶发酵24 h,菌液浓度可从8×10~8CFU/m L提升到3.4×10~9CFU/m L,增长了325%。提高发酵液中活菌浓度,为生产上枯草芽孢杆菌的高效发酵技术奠定了理论基础。2.菌株益生潜力评估通过体外耐酸碱试验,确定了JB286菌株的可进入体内的活菌浓度及其益生潜力;再通过动物试验,检验其安全性及其益生能力。将60只小鼠分为A、B、C三组,每组20只。A组为空白对照组,B组饲喂2×10~6CFU/m L的菌液,C组饲喂2×10~8CFU/m L的菌液,每周采样,连取3周。利用血清学检测、q RT-PCR、16S r RNA测序等技术检测不同饲喂浓度对不同饲喂阶段的免疫球蛋白和细胞因子含量、肠道紧密连接蛋白基因表达量、盲肠菌群微生物区系丰度的影响。结果表明:（1）与空白对照组（A组）相比,B、C组小鼠血浆免疫球蛋白（Ig A、Ig M、Ig G）和细胞因子（IL-2、IL-6）含量显著升高（P＜0.05）;（2）B、C组小鼠日增重高于A,但差异不显著（P＞0.05）。试验第一周对照组肠道紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin、Claudin-1）的表达量显著高于两处理组,但第三周时则显著低于两处理组,表明JB286有增强免疫和肠道屏障的效果。（3）JB286接种小鼠肠道菌群多样性升高,盲肠内Firmicutes等有益菌的相对丰度上升,有害菌的相对丰度下降。综上所述,适合菌株JB286的摇瓶发酵条件为初始p H 7.2、转速160 rpm、培养温度37°C,接种量6%～8%,装液量为20%;最佳培养基配比为:蛋白胨4%,葡萄糖2%,氯化钠5%,玉米粉5%,豆粕4%,酵母粉5%,硫酸锰1%。优化后的条件摇瓶发酵24 h,菌液浓度提升325%,可从8×10~8CFU/m L提升到3.4×10~9CFU/m L。饲喂JB286株对机体最有益的浓度为2×10~6CFU/m L。饲喂优化后的枯草芽孢杆菌JB286株能提高动物机体的体液免疫,调节肠道菌群组成,提高肠道菌群多样性和物种丰度,增强免疫力和抗感染能力。本研究明确了枯草芽孢杆菌JB286株的最适发酵条件,为枯草芽孢杆菌应用于生产提供了数据支撑和理论参考。
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