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本论文以天然多糖材料键合蛋白质为基础,设计和构建了形貌不同功能各异的多糖键合蛋白质转运体系。功能各异的多糖材料在本论文中得到应用和讨论,包括羟丙基纤维素(HPC)、葡聚糖(Dex)、壳聚糖(Chi)和细菌纤维素(BC)。
羧基化羟丙基纤维素分别与多种蛋白进行化学键合用于构建蛋白质转运体系。粒度分析和形貌表征的结果表明该方法可以把羟丙基纤维素成功而有效的包裹整个蛋白,形成单蛋白为核、羟丙基纤维素为壳的纳米胶囊结构(HPC-Protein)。研究表明,HPC的包裹对糖蛋白具有显著的催化活性增强的效果;从共混实验和酶动力学结果分析,对活性的促进作用可能是多糖改变蛋白周围氢键形成环境导致的。此外,HPC-Protein在高温,酸碱处理和蛋白酶水解处理后具有优于原本的稳定性能;粒径分析提供的稳定性提高的原因是HPC的包裹保持了更稳定的蛋白结构。HPC-Protein还具有温度响应性和较低的生物毒性。
鉴于人体缺少纤维素水解酶,HPC作为医药材料进入人体具有一定的风险,我们选用了水溶性多糖葡聚糖(Dex)以改善蛋白质转运体系的生物相容性。Dex氧化后,分别与多种蛋白质或酶进行化学键合,形成葡聚糖包裹蛋白的纳米胶囊(Dex-Protein)。光散射和透射电镜等表征证明了Dex-Protein具有单蛋白为核、多糖为壳的纳米胶囊结构。实验证明葡聚糖的包裹对多种蛋白的催化活性均具有促进作用,酶动力学数据(米氏常数)显示这种现象是由葡聚糖的存在造成的:多糖能改变氢转移和氢键平衡并因此改变催化过渡态中键裂解步骤。此外,这种结构为蛋白提供结构上的有效保护,使其在多种极端环境下(如高温,酸碱,盐度和蛋白酶存在等条件)保持较高的稳定性。Dex-Protein的整体功能均有明显增强,且尺寸均一结构明晰,生物毒性低。
大部分功能缺失是发生在细胞内部发生,因此能够高效透过细胞膜的蛋白转运体系可提供更有效的治疗。壳聚糖(Chi)通过酰胺化作用成功与蛋白进行了化学键合,实验证明键合后是以单个蛋白为核、壳聚糖为壳的纳米蛋白胶囊的结构。Chi-Protein具有较高的催化活性。由于壳聚糖的完整包裹对蛋白质本身的结构具有支持和保护的作用,蛋白在经历破坏性的处理后(如高温,酸碱和蛋白水解酶)仍能保持其完整的结构,使体系具有良好的稳定性。更重要的是,借助壳聚糖本身的生物膜透过性能,Chi-Protein具有高效的细胞内化能力:能够在较低浓度下,仍具有高效的进入细胞的能力。这对蛋白类药物和其他大分子药物的靶向运输和细胞内化能力的提升具有十分重要的意义。
延长蛋白在体内的循环时间是优化蛋白质转运体系作用效果的另一个途径。利用多糖纤维细菌纤维素的尺寸和形状效应来构建蛋白质载体,能够赋予蛋白载体以抵抗细胞吞噬和较长血液循环时间的特性。通过酰胺化反应实现蛋白在细菌纤维素纤维上的固定;测试证明固载后的蛋白仍具有高效的催化活性和稳定性。细胞内化行为和小鼠体内循环实验的检测证明蛋白固载的纤维素纤维具有优秀的抗细胞吞噬行为和较长的血液循环时间。这些结果证明了细菌纤维素纤维作为蛋白质类药物载体的可行性和用于长血液循环时间药物载体的前景。