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目的:了解HBs A阳性孕妇其新生儿发生HBV宫内感染的危险因素,为预防和控制新生儿HBV宫内感染提供参考。探讨乙型肝炎病毒感染外周血单个核细胞的情况,并利用原位PCR技术检测PBMC中HBV的表达情况,研究PBMC在发生HBV宫内感染中的作用。内容与方法:1.新生儿HBV宫内感染危险因素分析(1)研究对象连续收集2008年8月至2012年9月北京地区各级医院产前检查的HBs Ag阳性孕妇及其新生儿共312对作为队列,收集研究对象的临床流行病学数据并采集血液标本。(2)研究方法1)流行病学调查:采用巢式病例对照研究的方法,使用统一定制的调查表,对研究对象进行详细询问并记录,同时将临床检查结果一并填写进调查表中。2)血清学检测:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗夹心法,对研究对象的血液标本中的HBs Ag和HBe Ag进行检测;选取HBV S基因启动子和终止子附近的保守序列设计引物,检测血清和PBMC中的HBV DNA。3)统计分析方法:先将资料进行核查,然后录入Epi Data 3.1,建立数据库,然后用SPSS 22.0软件对数据进行处理与分析;计量资料的结果使用±S表示,分析方法使用t-text检验分析;计数资料的结果使用率或构成比表示,比较时使用t-text或者χ2检验;使用Excel2013和Graph Pad Prism5.0软件对图表进行处理。2.PBMC转染实验以及细胞原位PCR技术检测PBMC中HBV DNA和ccc DNA(1)PBMC转染实验通过PCR扩增得到HBV DNA基因组全长片段,通过连接构建入T载体,转入感受态细胞后,经涂板蓝白斑筛选阳性后扩大培养,使用含去除内毒素的质粒提取试剂盒提取质粒后,利用扩增时加入的酶切位点,酶切产物,得到高浓度HBV DNA全基因组质粒。分离健康人PBMC后,经过电转染方式将HBV DNA转染进入健康人PBMC中,通过培养后检测PBMC中HBV的表达。(2)细胞原位PCR技术检测PBMC中的HBV DNA和ccc DNA将获得的HBV感染者的血浆,经过Ficoll密度梯度离心法分离得到PBMC,通过细胞甩片机将PBMC离心固定至粘附载玻片上,利用原位PCR技术检测PBMC中的HBV DNA;使用滚环扩增加跨缺口原位PCR技术检测PBMC中的ccc DNA,在显微镜下观察其HBV DNA和ccc DNA在细胞中的分布和位置。结果1.HBV母婴传播的危险因素分析(1)HBs Ag阳性孕妇其婴儿血液标本的实验室检测结果分析对312例HBs Ag阳性孕妇及其新生儿的实验室检测结果表明,共142例孕妇其新生儿发生了HBV宫内感染,宫内感染率为45.5%(142/312)。142例宫内感染的新生儿中,血清HBs Ag阳性24例(7.7%,24/312),血清HBV DNA阳性61例,(19.6%,61/312),外周血单个核细胞中HBV DNA阳性81例,(26.0%,81/312)。其中有15例(4.8%,15/312)新生儿同时检测出血清HBs Ag阳性和HBV DNA阳性,9例(2.9%,9/312)新生儿全部检测结果均阳性。(2)HBs Ag阳性母亲发生新生儿HBV宫内感染的危险因素分析综合312例HBs Ag阳性母亲及其新生儿的临床流行病学数据、人口学调查数据及实验室检测结果进行分析,结果显示:170例(54.5%170/312)新生儿未发生宫内感染,142例(45.5%,142/312)新生儿发生宫内感染;母亲PBMC HBV DNA阳性100例(32.1%,100/312),其中67例发生宫内感染,33例未发生宫内感染,经卡方检验χ2=27.40,p<0.001;母亲HBe Ag检测阳性人数78例(25%,78/312)其中54例发生宫内感染,24例未发生宫内感染,经卡方检验χ2=20.82,p<0.001;母亲血清HBV DNA阳性137例(43.9%,137/312),其中73例发生宫内感染,64例未发生宫内感染,经卡方检验χ2=5.95,p=0.0147;表明母亲PBMC HBV DNA、血清HBV DNA和HBe Ag阳性是发生新生儿HBV宫内感染的危险因素,其它因素如分娩年龄、分娩方式、新生儿体重等均与HBV宫内感染无关。进一步分析母亲血清中HBV DNA含量与新生儿HBV宫内感染的关系发现,血清中HBV DNA的含量越高,发生宫内感染的概率越大。血清HBVDNA含量高于106copies/ml的孕妇对比血清HBVDNA含量低于103copies/ml的孕妇,其新生儿发生宫内感染的相对危险度为5.33(95%CI为2.78~10.2);血清HBV DNA在103copies/ml至106copies/ml之间的孕妇相对危险度为2.61(95%CI为1.07~6.38),经趋势卡方检验三组宫内感染率差异有统计学意义,χ2值为28.24,p<0.001。2.HBV DNA电转染PBMC实验利用PCR成功提取出HBV DNA全基因组序列,经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物条带与预期结果一致;连接转化后将提取的目的基因连接产物双酶切,其产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定;使用紫外分光光度计测得目的基因质粒浓度为20ng/ml;质粒通过电转染的方式转染健康人PBMC,培养6小时和24小时后的提取细胞DNA,利用荧光定量PCR方法检测细胞中HBV DNA的拷贝数,分别为5.67×103copies/ml和7.4×104copies/ml。3.发生宫内感染新生儿PBMC细胞原位检测分析利用原位PCR技术检测乙型肝炎患者PBMC细胞中HBV DNA的表达情况,以乙型肝炎患者肝组织石蜡切片为阳性对照,以核固红染色为背景颜色,肝组织和PBMC的细胞核中可以观察到蓝紫色团块;通过滚环扩增加跨缺口原位PCR技术对ccc DNA进行检测,在肝组织和细胞的细胞核中发现有蓝紫色团块。在对孕妇PBMC中ccc DNA原位检测的过程中发现,原位检测的阳性率与血清HBV DNA含量有相关性,通过对比74例样本发现,外周血HBV DNA含量高,PBMC中检测ccc DNA的阳性率越高。25例外周血HBV DNA含量高于106copies/ml的患者中HBV ccc DNA阳性43例(89.6%,43/48),26例外周血HBV DNA含量低于106copies/ml的患者中HBV ccc DNA阳性12例(46.2%,12/26),经卡方检验χ2=16.7,p<0.001;在针对62例母婴对的婴儿PBMC原位检测结果汇总发现,25例发生宫内感染的婴儿,其中22例PBMC中ccc DNA检测阳性,阳性率88%(22/25),fisher精确卡方计算结果显示p<0.001。结论本研究发现,HBs Ag阳性孕妇的血清HBe Ag、血清HBV DNA和PBMC HBV DNA阳性为生新生儿宫内感染的高危因素,对婴儿PBMC中HBV DNA的检测有助于判断宫内感染的发生;通过转染乙型肝炎病毒至健康人外周血单个核细胞,通过荧光定量PCR和细胞原位PCR技术检测证实PBMC可以感染HBV。利用滚环扩增加跨缺口原位PCR技术检测新生儿PBMC中ccc DNA证实宫内感染的发生与PBMC有关,被HBV感染的PBMC在发生新生儿HBV宫内感染的过程中发挥重要作用。