论文部分内容阅读
口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth diseasevirus，FMDV)引起偶蹄动物的一种烈性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)定为必须报告的传染病，我国规定为一类动物疫病。持续性感染问题是FMD研究的热点和难点，其形成机制至今无确切答案;近期，有研究报道外泌体(exosomes)可以介导病毒或病毒RNA在细胞间传播。因此，本研究以感染FMDV的PK-15传代细胞分离exosomes为研究对象，对exosomes介导FMDV RNA转移现象进行全面、深入的研究，并探讨其发生的分子机制，最终阐明exosomes在FMDV细胞间传播的生物学功能及作用。 1.收取感染FMDV的PK-15细胞上清液，利用ExoQuick-TC for Tissue CultureMedia and Urine分离试剂盒提取exosomes后，进行鉴定并分析其包裹的病毒成分。RT-PCR可检测到exosomes中存在FMDV RNA，Western blot没有检测到FMDV病毒衣壳蛋白;此外我们将所提exosomes进行电镜观察和质谱分析，透视电镜下可观察到直径为40-100nm的圆形囊泡;质谱技术分析了PK-15细胞分泌的exosomes蛋白质组成，鉴定了部分exosomes标志性蛋白分子，且未检测到FMDV蛋白。而后我们将上述提取的exosomes感染正常PK-15细胞，发现感染exosomes的PK-15出现细胞病变(CPE)。我们对感染exosomes的PK-15细胞进行western blot检测，可以检测到FMDV衣壳蛋白，表明exosomes包裹的FMDV感染性RNA能够在PK-15细胞中完成再次感染。 2.如前所述，为了验证在中和抗体存在下，exosomes能否保护FMDV逃脱中和抗体的中和作用。我们将从感染FMDV的PK-15细胞中分离的exosomes实验组及相应对照组分别与本实验室保存的FMDV中和抗体在体外作用1h，观察细胞病变情况并进行统计学分析，分析测定的病毒基因组含量差异。实验发现，中和抗体可以有效阻止FMDV感染PK-15细胞，但是不能有效阻止exosomes介导的FMDV转移。这个结果表明，exosomes可以保护FMDV逃避部分中和抗体的中和作用。 3.选用可以阻断exosomes分泌的两种抑制剂(10μm GW4869、5μmspiroepoxide)，我们将PK-15细胞感染FMDV，分别设立空白对照组，1％ DMSO对照组，GW4869组及spiroepoxide组，6h后收取细胞及上清液，使用qReal-time的方法检测exosomes和胞内FMDV RNA含量水平变化;实验发现，exosomes中抑制剂GW4869组及spiroepoxide组与1％ DMSO对照组相比，FMDV RNA水平显著降低，同时将上述各组提取的exosomes感染正常PK-15细胞分五个时间段收取细胞和上清液，检测胞内和胞外FMDV RNA含量水平变化，并进行感染滴度(TCID50)的测定。实验发现，胞内和胞外抑制剂GW4869组及spiroepoxide组与1％ DMSO对照组相比，FMDV RNA水平在各个时间段均呈不同程度的降低，且exosomes再感染敏感细胞的能力也随之下降;这些结果表明，exosomes介导的FMDV感染性RNA的转运与exosomes的合成、分泌呈正相关依赖性降低的方式，进一步佐证了Exosomes介导FMDV感染性RNA的转运现象;明确了Exosomes介导FMDV感染性RNA在细胞间的传播作用，揭示了口蹄疫病毒在细胞间传播的新途径，为口蹄疫的防控提供新思路。