哈茨木霉诱导cDNA文库的构建及表达序列标签的分析

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哈茨木霉(Trichodermaharzianum)是一种可通过多种机制的共同作用抑制数种植物病原菌的生防菌。通过构建哈茨木霉诱导菌丝体cDNA文库并随机挑选部分克隆进行了测序分析。目的在于寻找生防基因,进而从整体上了解哈茨木霉拮抗病害过程中防治机制的建立特点。  用胶态几丁质作碳源诱导培养哈茨木霉,DNS法测得48h几丁质酶活最高,取此时的菌丝体为实验材料,构建哈茨木霉菌丝体cDNA文库,并对文库进行5’端随机测序,然后对测序结果进行生物信息学分析,并筛选生物防治相关基因。  构建出含有1.06×106个克隆的高质量cDNA文库。转化克隆的平均插入片段长度大于700bp,文库的重组率为93.4%。通过对151个随机克隆的序列测定与生物信息学分析,结果文库的冗余度为3.7%,序列测定的准确性较高,该文库能够满足EST研究以及目的基因筛选的要求。随机选取的1632个克隆进行序列测定,在去除载体序列、模糊序列、核糖体序列以及小于100bp的序列后,共获得1386条成功EST序列,登录到GenBank中。经过聚类分析后,共获得915条独立基因(Unigenes),其中包含181条重叠群(Contigs)和734条单拷贝基因(Singlets)。经BLAST程序分析后,共有235条EST为未知新EST序列,预计表达142条新独立基因。以独立基因为研究对象,通过与GenBank中的非冗余蛋白质数据库比较分析,结果得到已知功能基因数为609条。通过GO分类法将已知功能基因进行了分类,其中与维持机体正常代谢相关的基因所占的比例最大。在对已知功能基因的筛选中,获得了41条与生物防治相关基因,占本库基因总数的4.5%,其比例高于哈茨木霉菌丝体cDNA文库中生防基因的比例(3.7%),按其作用机制不同划分为与溶菌作用相关基因、竞争作用相关基因、抗性作用相关基因、蛋白酶作用相关基因、参与抗病作用的保护酶相关基因。  试验成功地构建了哈茨木霉诱导菌丝体时期的基因表达图谱。通过与已构建的哈茨木霉菌丝体cDNA文库比较,初步了解在诱导抗病过程中哈茨木霉抗性相关基因的表达情况及抗病机制的运行,为进一步利用这些基因奠定基础。
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