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丁型肝炎病毒(hepatitis D virus,HDV)是一种类病毒样核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)病毒,这种缺陷型病毒需要乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)提供乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)用于病毒的组装、释放和感染。与单独的HBV感染相比,合并HDV感染后会加速肝硬化的程度,会增加暴发性肝炎和肝细胞癌的发生率。但是目前关于HDV的研究还是相对缺乏,因此加强对HDV的进一步研究是非常必要的。目前丁型肝炎病毒的获取方式有两种:一种是从丁型肝炎患者的血清中直接提取HDV,但我国丁型肝炎的患者比较少见,若想依赖从血清中直接提取HDV的这种途径不现实;另外一种是基于质粒瞬时转染HuH-7等细胞系的HDV包装方法,但是当研究需要大量病毒时工作量会明显增大,而且实验批次之间的可重复性也较差。最近厦门大学发表了基于腺病毒的HDV病毒包装新方法,解决了一定问题。但到目前为止尚没有HDV的稳定包装细胞系用于HDV的大规模生产和抗病毒药物评价。HDV是HBV的卫星病毒,为HBV感染的研究提供了替代工具。本研究欲构建HDV复制包装转座子载体并尝试转染不同的肝癌细胞系,验证各项HDV相关复制感染指标,最终筛选出具有高包装效率和高感染性的HDV单克隆稳定转染细胞系。本研究首先采用分子克隆方法构建出含HDV复制子和HBsAg表达框的piggyBac(PB)转座子载体并进行了功能评价。将构建好的载体瞬时转染Hu H-7细胞,通过检测细胞上清HDV RNA和HBsAg的含量初步确定载体的功能完好,相关功能基因得到有效表达,并通过浓缩细胞上清病毒后感染HBV受体钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白(Na+/taurocholate Cotransporting Polypeptide,NTCP)的稳定转染细胞系HepG2.N9确定了细胞上清含有感染性HDV颗粒。课题组成员应用该载体和其他HDV复制包装载体系统转染了多个人来源肝癌细胞系,通过应用嘌呤霉素快速大规模筛选最终获得一株HDV的高包装效率细胞系K7。本研究进一步通过化学发光法检测细胞上清HBV表面抗原的含量,ELISA检测细胞上清HBV preS1的水平,以及定量PCR检测细胞上清HDV病毒滴度,利用HBV受体NTCP稳定转染细胞系HepG2.N9评价了细胞上清HDV病毒体外感染性,结果表明本研究成功建立了支持HDV复制、包装、分泌的人源肝癌细胞系K7,其细胞上清可检测到大量的HBsAg并可检测到HBV preS1的存在,细胞上清HDV滴度达到1E+08GE/ml(GE,genome equivalents)以上,并且证明本细胞所分泌的HDV病毒体外具有较好的感染性。本实验通过构建含有HDV复制子和HBsAg表达框的HDV表达载体,尝试筛选不同来源的人肝癌细胞系,最终成功筛选出了具有较高包装效率和感染性的HDV包装分泌单克隆细胞系K7,解决了HDV大规模包装生产的难题,并为大规模筛选潜在抗丁型肝炎分子药物提供了稳定转染细胞模型。