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目的:小儿手足口病(Hand-foot-mouth Disease,HFMD)是一种死亡率高、伴有儿童相关的无菌性脑膜炎和严重的神经系统并发症的季节性流行性感染性疾病,主要是肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)感染。因此,本实验从病毒受体与细胞自噬角度,利用细胞形态学、蛋白相互作用等研究方法,探究了P-选择素糖蛋白配体-1(P-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1)在肠道病毒71型感染正常胃上皮细胞(normal gastric epithelial cell line-1,GES-1)诱导自噬调变中的作用,旨在为明确EV71致病机制提供重要的理论基础和实验依据,为手足口病的早期预防和临床治疗提供新的思路。方法:1.细胞培养与病毒感染分别培养人胃上皮细胞和横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcoma,RD-A),将细胞培养在含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和1%青霉素/链霉素(200 U/ml)的L-谷氨酰胺DMEM培养基内,并置于含5%CO2的37℃培养箱。待细胞增长至90%,经不含EDTA的胰蛋白酶消化进行传代培养。EV71(fuyang-0805)以一定的感染复数(indicated multiplicity of infection,MOI)感染GES-1。病毒感染3 h后清洗细胞,然后用含2%胎牛血清的新鲜培养基继续进行细胞培养,到感染的时间点后收取培养细胞和上清液。收集感染细胞内的病毒颗粒前,要3次反复冻融细胞。病毒原液存放在-80℃冰箱,感染之前4℃复苏,病毒滴度可通过50%组织培养感染剂量(50%tissue culture infectious doses,TCID50)表示,根据Reed–Muench法使用96孔板接种RD-A细胞进行不同病毒浓度梯度的感染来测定TCID50。2.细胞处理GES-1细胞以EV71滴度为MOI=10分别感染6、12、24小时。封闭时,在感染前用含PSGL-1抗体(2 mg/ml)培养基培养GES-1,阻止EV71与细胞受体PSGL-1的结合。通过荧光显微镜检测自噬标记蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1light chain 3,LC3)时,将培养的GES-1转染RFP-LC3/GFP-LC3质粒24小时后进行病毒感染,最后观察并在同一倍镜计数5个不同视野下细胞中荧光聚集点的数目和DAPI染色的细胞核数,并计算LC3荧光斑点数/细胞数的百分率。3.实时荧光定量PCR用TRIzol Reagent分别从不同GES-1细胞处理组提取细胞的总RNA,并通过快速c DNA第一链c DNA合成试剂盒将RNA(2μg)转换为c DNA。采用the Bestar?Sybr Green q PCR Mastermix通过实时荧光定量PCR技术检测PSGL-1的RNA水平变化,设置热循环条件:95℃初始变性2分钟;95℃变性10秒,退火温度63℃30秒,最后延伸72℃30秒,共40次循环。4.免疫荧光显微镜在4℃用含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液(PBS)固定细胞20分钟后清洗;用含1%Triton X-100的PBS在室温细胞穿孔15分钟;用含5%牛血清白蛋白PBS液在室温封闭60分钟;用LC3与PSGL-1单克隆抗体在4℃孵育,过夜。次日,清洗后加入荧光标记的二抗,并加入DAPI核染色;然后在荧光显微镜下观察并采集图像。5.免疫印迹和免疫共沉淀收集细胞并裂解;测定蛋白质浓度;样品通过SDS-PAGE电泳分离,并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜;膜用5%脱脂奶粉常温封闭2小时,然后分别孵育P62抗体,LC3抗体,VP1抗体,PSGL-1和β-actin抗体4℃过夜;清洗后,用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗在室温下孵育1小时。最后使用化学发光显影剂显影。免疫共沉淀:在4℃过夜孵育细胞裂解液与单克隆抗体(1 mg)后加入Protein G Agarose珠子,进行2小时的摇动孵育;洗涤珠子后溶解,取免疫共沉淀缓冲液通过12%的SDS-PAGE进行电泳分离(方法同免疫印迹)。6.统计分析采用t检验进行统计学比较,P<0.05判断有统计学意义。结果:1.EV71感染诱导GES-1细胞发生自噬:免疫印迹结果显示随着病毒感染时间的增加,LC3II逐渐增加,LC3-I向LC3II转换明显;且在12 h后呈明显增加(P<0.05),同时免疫荧光结果显示病毒感染12 h后LC3点状聚集明显增加(P<0.01)。2.PSGL-1抗体封闭受体可阻止EV71感染GES-1:GES-1细胞在PSGL-1抗体预先封闭后再染毒,与未封闭组相比胞内病毒蛋白结构蛋白VP-1明显减少(P<0.001),同时检测胞内病毒滴度也显著降低(P<0.01)。3.EV71感染GES-1促进PSGL-1高表达和点状聚集:通过免疫印迹检测显示感染组PSGL-1明显增多(P<0.05),同时实时荧光定量PCR测得感染组PSGL-1的m RNA水平明显升高(P<0.05);免疫荧光结果显示感染组PSGL-1出现明显点状聚集(P<0.01)。4.PSGL-1参与EV71感染GES-1诱导的细胞自噬:采用免疫荧光技术观察发现PSGL-1可与LC3在细胞内发生共定位,通过免疫共沉淀技术检测PSGL-1和P62有蛋白相互作用。结论:EV71感染GES-1诱导细胞自噬,而这一现象可能是EV71通过受体PSGL-1与P62之间的蛋白相互作用实现的。这些结果可能为帮助我们理解EV71诱导自噬的机制提供理论基础,为预防和治疗EV71感染提供一种新的策略和思路。