【摘 要】
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本研究以云南传统发酵豆豉中分离得到的胞外多糖（exopolysaccharide,EPS）高产菌株植物乳杆菌YM-4-3为研究对象,通过构建引导糖基转移酶cps2E和cps4E基因的单过量表达和双过表达菌株:YM-4-3-2E-OE,YM-4-3-4E-OE和YM-4-3-2E-4E-OE,探讨这两个基因对胞外多糖产量、分子量、组分和抗氧化活性的影响,并对多糖的官能团构成进行分析。另外,通过菌株体
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本研究以云南传统发酵豆豉中分离得到的胞外多糖（exopolysaccharide,EPS）高产菌株植物乳杆菌YM-4-3为研究对象,通过构建引导糖基转移酶cps2E和cps4E基因的单过量表达和双过表达菌株:YM-4-3-2E-OE,YM-4-3-4E-OE和YM-4-3-2E-4E-OE,探讨这两个基因对胞外多糖产量、分子量、组分和抗氧化活性的影响,并对多糖的官能团构成进行分析。另外,通过菌株体外抑菌实验,评估引导糖基转移酶过表达后对菌株活性物质产生的影响。同时,利用RNA-seq技术对过表达菌株和野生型菌株进行转录组分析,探究引导糖基转移酶过表达后的基因表达差异变化,明确引导糖基转移酶在植物乳杆菌YM-4-3菌株胞外多糖合成中的功能,为乳酸菌胞外多糖合成的调控提供理论依据。主要研究成果如下:1)利用表达载体pSIP409构建引导糖基转移酶基因cps2E和cps4E的过表达载体p SIP409-2E、p SIP409-4E和p SIP409-2E-4E。通过电击转化的方法将载体导入YM-4-3感受态细胞中,构建过表达菌株YM-4-3-2E-OE,YM-4-3-4E-OE和YM-4-3-2E-4E-OE。经测定,过表达菌株胞外多糖产量与野生型菌株相比均有显著提升（P<0.05）,提升量分别为30.15%、26.84%和36.29%。2)胞外多糖分子量分析结果显示野生型菌株YM-4-3和过表达菌株YM-4-3-2E-OE,YM-4-3-4E-OE和YM-4-3-2E-4E-OE的胞外多糖分子量分别为1.43×105 Da、3.48×105 Da、2.96×105 Da和1.98×105 Da。胞外多糖单糖组分分析发现菌株YM-4-3-4E-OE的胞外多糖组分最多,含D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-氨基葡萄糖、D-氨基半乳糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、L-岩藻糖、L-古洛糖醛酸、D-甘露糖醛酸、D-葡萄糖醛酸和D-半乳糖醛酸14种单糖;野生型菌株YM-4-3无L-鼠李糖、D-氨基半乳糖和D-木糖;菌株YM-4-3-2E-OE无L-古洛糖醛酸和D-半乳糖醛酸;菌株YM-4-3-2E-4E-OE无D-半乳糖醛酸。Fourier transform infrared spectroscopy（FT-IR）分析显示,四株菌所产胞外多糖均含有C-H键、C-O-C键和C-O-H键,含有糖醛酸,硫酸盐基团和硫酸盐基团取代基团。YM-4-3,YM-4-3-2E-OE和YM-4-3-4E-OE三株菌的胞外多糖含有α-糖苷键,菌株YM-4-3-2E-4E-OE胞外多糖不含α-糖苷键。3)各菌株对三七尖孢镰刀菌、香蕉炭疽菌和扩展青霉的生长均具有明显的抑制作用。其胞外多糖体对1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）、羟基自由基和超氧阴离子都具有一定的清除能力,且各菌株间无差异。4)转录组数据分析显示,与野生型菌株YM-4-3相比,菌株YM-4-3-2E-OE、YM-4-3-4E-OE和YM-4-3-2E-4E-OE分别有1386个、1395个和1458个表达显著性差异表达的基因。引导糖基转移酶基因过表达后使胞外多糖合成基因簇中部分基因和糖代谢途径中的一些基因出现表达差异。过表达菌株在糖酵解途径中,6-磷酸果糖激酶1和葡萄糖激酶表达上调,可导致葡萄糖-6-磷酸的积累;而磷酸戊糖途径中,6-磷酸葡萄-1-脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶表达下调,对葡萄糖-6-磷酸的消耗降低,可使更多的葡萄糖-6-磷酸进入到糖异生途径,进而促使胞外多糖产量提高。
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