论文部分内容阅读
随着合成生物学的迅猛发展,底盘细胞的构建在生物技术领域展现了巨大的应用前景。而微生物基因组的精简优化逐渐成为构建底盘细胞的重要策略。假单胞菌(Pseudomonas)具有明显的代谢和生理多样性,因此能够抵抗各种内源和外源压力,合成多种生物活性物质,适应不同的物理化学和营养生境。同时,随着假单胞菌基因组数据的大量公布,促使其遗传背景逐渐清晰。因此,环境来源的假单胞菌属工业生产菌株能够作为模式菌株,进行基因组的删减和遗传改造,从而构建优势小基因组菌株生产工业、农业和医药领域的重要化学品和药品,满足当前和未来合成生物学和生物技术的需求。绿针假单胞菌GP72(P.chlororaphis GP72)是本实验室从甜椒根际分离得到的生防菌株,能够分泌吩嗪(phenazine)类抗生素和其他生防活性的次级代谢产物。本研究以绿针假单胞菌为主要研究对象,开展假单胞菌属根际促生菌的比较基因组学研究,得到的研究结果一方面用于指导提高菌株生防特性的研究,另一方面指导菌株基因组删减工作,从而构建高产吩嗪类化合物的小基因组菌株。我们根据底盘细胞的构建需求,首先利用比较基因组学的方法掌握绿针假单胞菌根际促生特性的基因、必需基因以及重要功能基因和调控基因;然后采用无痕敲除方法进行大片段的基因组连续删减,从而构建系列小基因组菌株;最后对菌株的生物学特性进行表征,为后续合成生物学的研究和工业化生产提供详细的理论依据和优化的技术支持。本课题的主要研究内容和发现包含以下四个方面:第一、利用高通量测序技术完成了对绿针假单胞菌GP72的全基因组测序。菌株GP72的基因组是该种公布的第一个组学数据,为6,663,241 bp长度的环状染色体,其G+C含量为63.1%。基因组注释揭示了菌株生防作用的遗传基础。第二、开展四株代表性假单胞菌属根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)的比较基因组学研究。通过比较非致病性的生防菌株荧光假单胞菌Pf-5(P.fluorescens Pf-5)和绿针假单胞菌GP72,甜瓜根际分离的生防菌株铜绿假单胞菌M18(P.aeruginosa M18)以及根际固氮细菌斯氏假单胞菌A1501(P.stutzeri A1501)的基因组系统性揭示根际促生特性的相关基因。菌株GP72的编码基因与其他三株细菌的基因组同时比较,得到603个保守性基因,揭示了假单胞菌属PGPR的根际促生共性。而在菌株GP72中存在的特异性促生基因包括:合成不同的次级代谢产物、差异的重金属抗性机制(cus操纵子)以及额外的菌毛合成系统(tad操纵子),揭示了绿针假单胞菌对环境的适应性和特异的生物学功能。第三、初步掌握绿针假单胞菌的必需基因信息。与不同革兰氏阴性菌的必需基因进行序列比对,推测绿针假单胞菌GP72中的必需基因至少为215个,为后续基因组精简与优化奠定了基础。第四、利用比较基因组学的方法结合“自上而下”基因组删减策略,从而构建假单胞菌属的优势小基因组菌株。本文采用自杀性质粒介导的同源重组方法连续敲除22个染色体片段,占基因组的10%。在22个突变株中,最小基因组菌株MDS22的2-羟基吩嗪产量是原始菌株的4.4倍,为99.1 mg/L,但该菌株的生长缓慢;而在菌株MDS10中,吩嗪总产量最高,为852.0 mg/L,且表现良好的生长趋势。高产吩嗪菌株MDS10的转录组数据显示其高产特性可能与吩嗪的分泌有关,且菌株的生长和吩嗪的合成与铁离子代谢密切相关。综上,本文以绿针假单胞菌GP72为主要研究对象,从合成生物学的角度,利用比较基因组学的原理与方法,实现了绿针假单胞菌最小基因组菌株的构建,同时得到系列高产吩嗪类化合物的优势小基因组菌株。因此,通过本文研究为后续理想底盘细胞的构建,为下一步的合成生物学研究和生物技术应用奠定了一定的理论和技术基础。