【摘 要】
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南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)由介体白背飞虱以持久增殖型传播,该病毒已成为威胁我国水稻产量的重要的病毒之一。本文通过酶解
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南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)由介体白背飞虱以持久增殖型传播,该病毒已成为威胁我国水稻产量的重要的病毒之一。本文通过酶解法获得有较高活性的水稻原生质体,建立病毒侵染原生质体系,将抗体与荧光素交联,利用抗体与抗原特异性结合原理,通过激光共聚焦显微镜观察病毒在原生质体内的复制及表达。同时通过实时荧光定量PCR以及Western blot检测病毒相关基因转录及其蛋白的表达动态。首先通过Gateway系统进行原核表达,免疫兔子获得SRBSDV结构蛋白P10和非结构蛋白P9-1的抗血清,间接ELISA测定其效价分别为6400倍和3200倍,Western blot检测结果表明两个抗体均可特异性检测感病毒株。利用IC-RT-PCR和Dot-blot ELISA方法来检验两个抗体的灵敏度,两者的检测结果表现一致,说明SRBSDV的P9-1蛋白的抗体及P10蛋白的抗体具有较强的灵敏度。利用PEG介导SRBSDV病毒侵染原生质体,培养48h后利用荧光素交联的P9-1、P10抗体进行孵育,共聚焦显微镜下观察发现,P10蛋白的表达量少于P9-1蛋白表达量。通过荧光定量PCR检测结果显示,SRBSDV的S5-1、S5-2、S6、S7-2、S9-1、S9-2基因在原生质体内36h左右表达达到高峰,S7-1以及S10基因在水稻原生质体内48h左右表达达到峰值。而通过Western blot检测结果显示,SRBSDV的P5-1、P6、P9-1蛋白在原生质体内48h左右表达达到高峰,P7-1及P10蛋白在原生质体内60h左右表达达到高峰。
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