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狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)是指系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)合并双肾不同病理类型的免疫性损害,同时伴有明显肾脏损害临床表现的一种免疫炎症性疾病。其发病机理和治疗方法一直是研究的重点和热点。最近研究发现,Kruppe样因子15(Kruppel-like factor 15,KLF15)可通过调控核因子-B(Nuclear Factor-κB,NF-κB)引起炎症及免疫反应,使肾小球产生病理变化,在LN的发生发展中起着重要作用。羟基氯喹(Hydroxychloroquine,HCQ)近年来被广泛地应用于治疗SLE,并具有较好的疗效,是目前临床治疗SLE重要药物。研究显示,羟基氯喹对狼疮肾也有一定的保护作用。但羟基氯喹不良反应较多,对其长期使用造成了局限。青蒿素(Artemisinin,ART)具有一定的抗炎免疫抑制活性,且其不良反应较少,适合长期服用。故用青蒿素与羟基氯喹进行配伍(AH),有可能在保证药效作用不变的前提下减少羟基氯喹的使用量,从而降低其毒副作用,在临床治疗上达到新的突破。目的:1、探讨通过AH治疗能否达到降低羟基氯喹使用剂量、减少其不良反应的目的。2、观察AH治疗甲醛化空肠弯曲菌加佐剂诱发LN模型小鼠及同种异体淋巴细胞诱发LN模型小鼠的药效学作用。3、考察甲醛化空肠弯曲菌加佐剂诱发LN模型小鼠及同种异体淋巴细胞诱发LN模型小鼠KLF15、NF-κB的表达特征,从基因水平探讨LN的发病机制,阐明AH治疗LN的作用环节,为探讨和防治LN策略开拓新靶点。方法:1、进行AH对小鼠免疫功能的影响实验,药物分为AH=1:3[(8.3mg青蒿素+25mg羟基氯喹)· kg-1]、AH=1:1[(16.7mg 青蒿素+16.7mg 羟基氯喹)· kg-1]及 AH=3:1[(25mg青蒿素+8.3mg羟基氯喹)· kg-1]三个剂量组并进行灌胃给药。选取药物最佳配伍比例,进行后续实验。采用植物血球凝集素-P(Phytohemagglutinin-P,PHA-P)刺激分离的小鼠淋巴细胞,观察AH三个剂量组对小鼠淋巴细胞转化率的影响;采用鸡血红细胞作免疫原进行溶血素测定,观察AH三个剂量组对小鼠血清溶血素含量的影响;采用碳粒廓清法检测巨噬细胞吞噬功能,观察AH三个剂量组对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响;评价AH的免疫抑制作用。2、由免疫功能初实验选取青蒿素、羟基氯喹的最佳配伍比例AH=1:3,根据羟基氯喹单用剂量(33.3 mg · kg-1),制定 AH 低、中、高(16.7、33.3、66.6 mg · kg-1)剂量组进行实验。(1)模型的建立①甲醛化空肠弯曲菌加佐剂诱发小鼠LN模型的建立足跖注射空肠弯曲菌加佐剂混合液,三周后尾静脉注射空肠弯曲菌悬液,建立甲醛化空肠弯曲菌加佐剂诱发小鼠LN模型。②同种异体淋巴细胞诱发小鼠LN模型的建立无菌提取KM小鼠脾脏淋巴细胞,用刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)刺激后,皮下注入实验组KM小鼠体内,建立同种异体淋巴细胞诱发小鼠LN模型。(2)检测方法采用AH低、中、高剂量对其进行干预治疗,观察小鼠一般情况,运用Bradford法检测小鼠尿蛋白含量、ELISA法检测小鼠血清肌酐(serum creatinine,SCr)、尿素氮(blood usea nitrogen,BUN)、血清白蛋白(albumin,ALB)、抗 ds-DNA(anti double stranded DNA,anti ds-DNA)、抗核抗体(antinuclear antibodies,ANA)、免疫球蛋白 G(Immunoglobulin G,IgG)、γ-干扰素(interferon γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及转化生长因子-β1(transforming growth factor-β 1,TGF-β1)含量,病理组织切片观察小鼠肾脏,脾脏的变化,评价AH对LN小鼠的药效作用;采用RT-PCR技术检测KLF15、NF-κ B mRNA的表达,深入探讨AH治疗LN的作用机制。结果:1、AH对小鼠免疫功能的影响(1)AH=1:3组、AH=1:1组及AH=3:1组淋巴细胞转化率低于正常对照组(P<0.01)。(2)AH=1:3组及AH=1:1组的血清溶血素含量低于正常对照组(P<0.01)。(3)AH=1:3组的碳粒廓清指数K低于正常对照组(P<0.01);AH=1:3组的吞噬指数α低于正常对照组(P<0.01)。结果显示,AH=1:3可降低小鼠淋巴细胞转化率,可降低小鼠血清溶血素含量,可降低碳粒廓清指数K和吞噬指数α,具有较好的免疫抑制作用。2、AH对小鼠LN模型的影响(1)AH对甲醛化空肠弯曲菌加佐剂诱发小鼠LN模型的影响与模型对照组比较,AH低、中、高剂量组小鼠的精神状态、饮食、毛色、活动状态更佳;尿蛋白含量均显著降低(P<0.01);中、高剂量组小鼠血清SCr含量有所降低(P<0.01,P<0.05);低、中、高剂量组小鼠血清BUN无显著降低(P>0.05);高剂量组小鼠血清ALB含量升高(P<0.05);低、中剂量组小鼠血清抗ds-DNA含量降低(P<0.05);中剂量组小鼠血清ANA含量有所降低(P<0.01);低、中、高剂量组小鼠血清IgG含量有所降低(P<0.01,P<0.05);低、中、高剂量组小鼠血清IFN-γ含量有所降低(P<0.01,P<0.05);低、中、高剂量组小鼠血清TNF-α含量均明显降低(P<0.01);高剂量组小鼠血清TGF-β1含量升高(P<0.05);AH治疗组小鼠肾小球大小及形态有所恢复,系膜细胞减少,系膜区渐窄,以中、高剂量组效果最为明显;AH治疗组小鼠,脾脏胞间质水肿改善,脾小体增生减少,以中、高剂量组效果最为明显;低、中、高剂量组的KLF15mRNA表达水平均显著升高(P<0.01);低、中、高剂量组的NF-κ B mRNA表达水平均显著降低(P<0.01)。(2)AH对同种异体淋巴细胞诱发小鼠LN模型的影响与模型对照组比较,AH低、中、高剂量组小鼠的精神状态、饮食、毛色、活动状态更佳;低、中、高剂量组小鼠尿蛋白含量均显著降低(P<0.01,P<0.05);低、中、高剂量组小鼠血清SCr含量均显著降低(P<0.01);低、中、高剂量组小鼠血清BUN均显著降低(P<0.01);中剂量组小鼠血清ALB含量升高(P<0.05);低、中、高剂量组小鼠血清抗ds-DNA含量均显著降低(P<0.01);低、中、高剂量组小鼠血清ANA含量均显著降低(P<0.01);低、中、高剂量组小鼠血清IgG含量均显著降低(P<0.01);低、中、高剂量组小鼠血清IFN-γ含量均显著降低(P<0.01);低、中、高剂量组小鼠血清TNF-α含量有所降低(P<0.01,P<0.05);低、中、高剂量组小鼠血清TGF-β1含量显著升高(P<0.01,P<0.05);AH治疗组小鼠肾小球大小及形态有所恢复,系膜细胞减少,系膜区渐窄,以中、高剂量组效果最为明显;AH治疗组小鼠,脾脏胞间质水肿改善,脾小体增生减少,以中、高剂量组效果最为明显;低、中、高剂量组的KLF15 mRNA表达水平均显著升高(P<0.01);低、中、高剂量组的NF-κ B mRNA表达水平均显著降低(P<0.01)。结论:1、表明AH能够抑制细胞免疫,体液免疫,非特异性免疫,其中AH=1:3具有较好的免疫抑制作用,在保持药效的情况下,二药联用可降低羟基氯喹使用剂量、减少其不良反应。2、AH对甲醛化空肠弯曲菌加佐剂诱发LN模型小鼠及同种异体淋巴细胞诱发LN模型小鼠具有良好的治疗作用,可降低小鼠血清中的SCr、BUN、抗ds-DNA、ANA、IgG、IFN-γ、TNF-α含量,可升高小鼠血清中的ALB、TGF-β1含量,可改善小鼠的肾脏、脾脏病理损害。3、AH可升高甲醛化空肠弯曲菌加佐剂诱发LN模型小鼠及同种异体淋巴细胞诱发LN模型小鼠肾组织KLF15 mRNA的表达水平,以及降低NF-κB mRNA的表达水平,从基因水平上阐明了 AH治疗LN的作用环节。