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研究背景在过去半个多世纪对肿瘤所进行的分子生物学、组学以及系统生物学研究,大大提高了人们从单个细胞生物学层面诠释肿瘤的生物学和临床行为的能力。鼻咽癌(nasopharyngeal cancer,NPC)为一种来源于鼻咽上皮的高度恶性肿瘤,具有高度局部转移及早期远处转移的特征,是我国常见的一种恶性肿瘤,其发病可能与多种因素有关,如环境、基因易感性等因素相关,也与EBV(Epstein-Barr virus)病毒感染有关。放射治疗是治疗鼻咽癌的常用方法,虽然该治疗手段较大的提高了鼻咽癌治疗缓解率,但其5年平均生存率仍维持在70%左右,主要原因之一是有相当一部分患者在经过治疗后的数年内发生了复发或者远处转移。放疗是治疗鼻咽癌(NPC)的重要手段,放疗耐受极大的限制了鼻咽癌临床疗效和病人预后,因此,深入研究鼻咽癌放疗耐受机制及寻找一种可能的放疗耐受诊断分子标志物极为迫切。鼻咽癌的发生发展是一个极其复杂的过程,在此过程中蛋白编码基因无疑起到至关重要的作用,而microRNA在鼻咽癌的发病机制中同样发挥重要作用。在高等哺乳动物细胞的基因组中,仅有约2%的序列为蛋白编码基因,绝大多数转录是源于基因组的非蛋白编码区域(noncodingRNA)。其中一类长约21到23个核苷酸组成,称为微小RNA(microRNA,miR),miR以序列特异性方式与其下游基因RNA中的靶序列结合,在转录后水平(RNA的稳定性和翻译)抑制靶基因的表达,继而对高等生物个体发育过程中所有的生物学事件:细胞增殖、信号转导、细胞分化、DNA损伤修复、细胞黏附和运动、炎性反应、细胞衰老和死亡等施加影响。在多达2588个人的miRNA中,已知有超过100个miRNA在包括肿瘤在内的重大疾病中表达异常,参与疾病发生发展和病理学行为。miRNA的表达异常可显著地改变细胞生长、分化、凋亡以及肿瘤转移等生理及病理过程,推动肿瘤发生发展进程,也在众多肿瘤研究中被证实与肿瘤放疗耐受相关。研究目的针对探索鼻咽癌放疗耐受机制这一核心课题,通过多种实验手段阐明:在鼻咽癌放疗耐受和放疗敏感细胞株中寻找表达具有显著差异的基因;在细胞和动物实验水平中阐明相关基因在鼻咽癌细胞放疗耐受形成中的分子机制;应用双荧光报告系统寻找miR-20a-5p、Rab27B基因可能参与的信号通路。为临床遇到的鼻咽癌放疗耐受难题提供新的思路。研究方法1)结合软件分析,应用组学测序、real-time RCR和western等手段,发现、筛选与鼻咽癌放疗耐受密切相关基因包括miR-20a-5p,利用预测网站miRDB(http://mirdb.org/miRDB/)、Targetscan(http://www.targetscan.org/)等预测miR-20a-5p的下游基因,real-time RCR和western实验初步确定Rab27B是miR-20a-5p的下游调控基因,而mimic和antagomir的转染实验,以及3’UTR实验确认了 Rab27B是miR-20a-5p基因的下游调控基因。2)应用miR-20a-5p的mimic转染CNE-2细胞株模拟miR-20a-5p表达水平上调,使用real-time PCR检测miR-20a-5p和Rab27B表达量变化,并应用western检测Rab27B的表达变化;应用miR-20a-5p antagomiR转染CNE-1细胞株模拟其水平下调,使用real-timePCR检测miR-20a-5p和Rab27B表达量变化,并应用western检测Rab27B的表达变化。3)应用流式细胞技术检测CNE-2细胞内提高miR-20a-5p或降低Rab27B量对鼻咽癌细胞CNE-2细胞周期和细胞凋亡的影响。进而在体外裸鼠实验中应用western检测裸鼠瘤体中Rab27B表达差异。应用双荧光报告系统寻找miR-20a-5p、Rab27B可能参与的信号通路。研究结果1)通过组学测序结果发现miR-20a-5p基因在鼻咽癌放疗耐受敏感细胞株中的表达具有明显差异,通过多个网站预测到miR-20a-5p可能调控的基因,western和real-timePCR检测,发现Rab27B基因的表达与miR-20a-5p具有显著的负相关性,Rab27B基因是miR-20a-5p的下游调控基因。2)应用miR-20a-5p的mimic转染CNE-2细胞株(放疗敏感株,内源性表达较低)模拟miR-20a-5p表达水平上调,使用real-timePCR检测miR-20a-5p和Rab27B表达量变化,并利用western检测Rab27B的表达变化。同时应用miR-20a-5p antagomiR转染CNE-1细胞株(放疗耐受株,内源性表达较高)模拟其水平下调,使用real-timePCR检测miR-20a-5p和Rab27B表达量变化,并利用western检测Rab27B的表达变化。结果进一步表明Rab27B是miR-20a-5p下游调控基因。3’UTR实验证实Rab27B是miR-20a-5p的下游调控基因。3)在CNE-2细胞中增加miR-20a-5p的表达量后CNE-2细胞对放疗耐受性显著增加,表明miR-20a-5p可能与鼻咽癌细胞的放疗耐受敏感性有关;而在CNE-2细胞中降低Rab27B的表达量,通过在CNE-2细胞内转染干扰Rab27B增加了CNE-2细胞的放疗耐受性,表明miR-20a-5p与Rab27B 一起参与调控鼻咽癌细胞的放疗敏感性,为miR-20a-5p通过调节Rab27B表达参与调控鼻咽癌细胞放疗耐受敏感性的推测提供实验依据;在另一株放疗耐受性细胞CNE-1中进行类似机制验证,表明miR-20a-5p与鼻咽癌细胞的放疗耐受性密切相关;在CNE-1细胞中提高Rab27B的表达量,通过在CNE-1细胞内转染过表达Rab27B,与降低miR-20a-5p的表达量后CNE-1细胞对放疗耐受性检测结果一致,均降低了 CNE-1细胞的放疗耐受性,这表明miR-20a-5p通过调节Rab27B表达量参与调控鼻咽癌细胞的放疗耐受敏感性。4)增加miR-20a-5p的表达量后CNE-2细胞的迁移能力显著增加,干扰Rab27B的CNE-2细胞显著促进了 CNE-2细胞的迁移能力,表明miR-20a-5p通过Rab27B参与调控鼻咽癌细胞的放疗耐受敏感性可能与它们促进细胞迁移能力密切有关;同时,在CNE-1细胞中过表达Rab27B,与降低miR-20a-5p的表达量后CNE-1细胞结果一致,均显著抑制了 CNE-1细胞的侵袭能力,表明miR-20a-5p通过调节Rab27B表达参与调控鼻咽癌细胞的放疗耐受敏感性可能与它们促进细胞侵袭能力密切有关。5)鼻咽癌放疗敏感细胞株CNE-2细胞内提高miR-20a-5p或降低Rab27B表达量后细胞凋亡显著减少;鼻咽癌放疗耐受细胞株CNE-1分别细胞转染miR-20a-5p的antagomir及其对应control后细胞早期凋亡明显增加。6)在CNE-2细胞中分别注射miR-20a-5p的mimic及其对应的control后裸鼠瘤体重量由0.45克增加到1.23克,这与miR-20a-5p促进鼻咽癌细胞放疗耐受性结论一致。而在CNE-1细胞中分别注射miR-20a-5p的antagomir及其对应的control后裸鼠瘤体重量由0.36克减少到0.01克,这也与miR-20a-5p促进鼻咽癌细胞放疗耐受性结论是一致的。体外裸鼠成瘤实验结果支持了 miR-20a-5p通过调节Rab27B表达显著增加了鼻咽癌细胞的放疗耐受性。7)利用双荧光素酶报告基因检测系统寻找miR-20a-5p、Rab27B可能参与的信号通路。结果表明,在与癌症相关的18条信号通路中,在CNE-1和CNE-2细胞中表达差异大于10倍的有3个信号通路:Hypoxia、Notch和MEF2通路。CNE-2和CNE-1细胞中分别注射miR-20a-5p的mimic和antagomir及其对应的control,Qiagen CignalTM reporter assay检测差异较大的3个信号通路的转录因子的变化,在CNE-2细胞中分别注射miR-20a-5p的mimic及其对应control后,3个信号通路(Notch、Hypoxia和MEF2通路)的转录因子表达分别变化0.81、6.88和8.74倍;在CNE-1细胞中分别注射miR-20a-5p的antagomir及其对应control后,3个信号通路(Notch、Hypoxia和MEF2通路)的转录因子表达分别变化3.41、0.39和4.34倍,结果表明miR-20a-5p/Rab27B可能是通过MEF2信号通路参与调节鼻咽癌细胞放疗耐受性。进一步的生物信息分析与Rab27B相互作用的基因,提示SYTL2、MLPH和DIT3基因可能与Rab27B有直接相互作用关系。研究结论1)通过组学测序、实验验证等方法,首次发现miR-20a-5p基因在鼻咽癌放疗耐受/敏感细胞株中表达有显著差异,而Rab27B基因的表达与miR-20a-5p具有负相关性,表明Rab27B是miR-20a-5p的下游调控基因。2)在鼻咽癌放疗敏感细胞株CNE-2和放疗耐受细胞株CNE-1中发现miR-20a-5p基因通过负向调控Rab27B基因显著增加鼻咽癌细胞放疗耐受性。3)miR-20a-5p基因通过负向调控Rab27B基因表达可能是通过促进鼻咽癌细胞迁移能力、侵袭能力和减少鼻咽癌细胞凋亡等机制增加鼻咽癌细胞放疗耐受性。4)miR-20a-5p基因通过负向调节Rab27B基因表达可能是通过MEF2信号通路参与调控鼻咽癌细胞放疗耐受敏感性,与Rab27B相互作用的基因可能有SYTL2、MLPH、DIT3 等基因。