论文部分内容阅读
口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种烈性动物传染病,严重危害畜牧业健康发展和公共卫生安全,我国将其列为一类动物疫病。目前控制该病的主要方法是抗体检测和疫苗免疫相结合。FMDV有7个血清型,不同血清型的FMDV之间无交叉保护性,引起我国牲畜发病的血清型主要有O、A、AsiaⅠ三个血清型,其中O型流行最为广泛。VP1蛋白作为O型FMDV的主要结构蛋白,包含其中大部分刺激机体产生中和抗体的中和性抗原位点,分别位于羧基端200-213位氨基酸残基的线性表位上、B-C环上和G-H环内,因此VP1抗体作为FMDV免疫产生的主要中和抗体,是评估疫苗免疫效果的重要依据。本试验将转化了VP1融合蛋白基因的JM109在IPTG的诱导下进行表达并进行表达条件的优化;以VP1融合蛋白(rVP1蛋白)为包被抗原建立了间接ELISA抗体检测方法,以PEG 2000为融合剂将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,有限稀释法筛选阳性克隆,制备单克隆抗体并进行鉴定。试验结果如下:1、O型FMDV VP1基因的克隆与原核表达参考GeneBank上发表的O型FMDV VP1基因序列,设计两条特异性引物,通过PCR扩增,将其克隆至表达载体pQE-30上,转化至大肠杆菌JM109中,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE鉴定,结果显示:VP1基因扩增产物条带大小约为560 bp,与预期扩增片段大小一致;表达的O型rVP1蛋白大小约为26 kDa,纯化效果较好,未见其他杂带,蛋白浓度达2.85 mg/mL,说明O型rVP1蛋白得到了高效地表达;Western-blot鉴定结果说明表达的O型rVP1蛋白具有很好的反应原性。O型rVP1蛋白的成功表达为建立O型FMDV VP1抗体血清学检测方法打下了基础。2、间接ELISA检测抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗体方法的建立采用方阵滴定法对抗原包被浓度、包被条件、血清稀释浓度、酶标二抗稀释浓度、最适封闭剂进行筛选,进行特异性实验。结果显示:最佳包被抗原浓度为2.0μg/mL,最佳包被温度和时间为4℃过夜,血清最适稀释倍数为l∶200,酶标二抗最适稀释倍数为l∶3000,最适封闭液为1%BSA-PBST溶液。该方法与A型FMDV、AsiaⅠ型FMDV、SVDV阳性血清不发生反应,仅与O型FMDV阳性血清反应,表明其特异性良好。本研究建立的间接ELISA为我国O型FMDV VP1抗体检测提供了一种简便快捷的检测方法。3、抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的鉴定及鉴定本研究以高浓缩的O型FMDV灭活疫苗免疫BALB/c小鼠,取阳性免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,采用间接ELISA方法鉴定,经4次亚克隆后,筛选能稳定分泌抗O型FMDV VP1蛋白MAbs的杂交瘤细胞株。将杂交瘤细胞株注入小鼠腹腔制备腹水,选取腹水效价高的杂交瘤细胞株进行单抗亚型鉴定及纯化;测定杂交瘤细胞的染色体数目、相对亲和力常数、特异性、稳定性等生物学特性;采用阻断ELISA试验检测单抗与O型FMDV反应的特异性。结果:筛选出了1株可稳定分泌抗O型FMDV VP1蛋白抗体的杂交瘤细胞株(1C7),1C7的染色体数高于任一亲本细胞的染色体数目;腹水的抗体效价为1:105,浓度为4.7 mg/m L。1C7分泌的MAbs亚型鉴定为Ig G2b;相对亲和力常数为1.5 mol/L;间接ELISA试验结果表明其可以特异性地与O型FMDV反应,而与A型、AsiaⅠ型FMDV及猪水泡病病毒均不发生交叉反应;Westernblot试验结果表明MAbs可特异性与原核表达的O型重组VP1蛋白(O-rVP1)反应;杂交瘤细胞传代至30代、在液氮中冻存12月后复苏,其分泌抗体稳定;阻断ELISA试验表明1C7单抗能够被O型FMDV免疫血清特异性地阻断。本研究为进一步建立基于单抗检测O型FMDV抗体和病原的阻断ELISA及胶体金免疫层析快速检测方法奠定了基础。