【摘 要】
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精氨酸酶是目前已知的唯一一个在植物体内产生脲的酶,其活力的强弱决定着精氨酸向合成脲、多氨或者一氧化氮的代谢方向发展,与植物生长发育调控和氮素利用密切相关。该蛋白由细胞核基因表达,通过导肽定位于线粒体发挥功能,不同物种中该酶的基因拷贝数、表达方式和功能并不相同。例如拟南芥中有2个精氨酸酶基因ARGAHI和ARGAH2,其中ARGAH2在根、茎的生长点和叶片表达量高,且发挥主要功能,与拟南芥根系发育调
【机 构】
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中国农业科学院生物技术研究所,北京100081
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精氨酸酶是目前已知的唯一一个在植物体内产生脲的酶,其活力的强弱决定着精氨酸向合成脲、多氨或者一氧化氮的代谢方向发展,与植物生长发育调控和氮素利用密切相关。该蛋白由细胞核基因表达,通过导肽定位于线粒体发挥功能,不同物种中该酶的基因拷贝数、表达方式和功能并不相同。例如拟南芥中有2个精氨酸酶基因ARGAHI和ARGAH2,其中ARGAH2在根、茎的生长点和叶片表达量高,且发挥主要功能,与拟南芥根系发育调控和抗病相关；水稻精氨酸酶基因OsARG为单拷贝组成型表达,与水稻氮素利用效率和子粒产量相关。棉花是重要的经济作物,也是一个高消耗氮肥的农作物,氮肥不足能够导致棉花减产50％以上。挖掘棉花氮素利用效率相关基因以及研究其功能,对保证棉花稳产、高产和减少投入、保障农民增收具有重要意义。尤其是陆地棉基因组序列的发布,大大加速了棉花氮素利用效率相关基因的克隆和功能研究。本研究利用CRISPR-Cas9系统定向诱变陆地棉(AADD)品系R18精氨酸酶基因,培育精氨酸酶基因棉花突变体,为进一步研究陆地棉精氨酸酶基因GhARG的功能提供实验材料。首先利用同源克隆技术获得了陆地棉精氨酸酶基因组序列,通过基因组序列比对结合Southern blot检测分析,证明棉花精氨酸酶基因在陆地棉基因组内存在2个拷贝,分别以单拷贝的形式存在于A染色体组和D染色体组,且2个拷贝的基因组序列同源性超过99％。利用5RACE获得的RNA序列分离了2个拷贝精氨酸酶基因第一个外显子,依据第一个外显子保守区域设计了3个长度20 bp的编辑位点,分别构建U6启动子驱动的sgRNA表达盒。将sgRNA插入Cas9植物表达载体构建获得了3个sgRNA：Cas9双基因表达载体,导入农杆菌GV3101后侵染棉花下胚轴,通过组织培养方法诱导愈伤组织。利用限制性内切酶消化PCR产物方法,分别对每个表达载体遗传转化获得的愈伤组织进行编辑效率检测,检测结果表明3个表达载体的编辑效率达到10％～90％。本研究结果为CRISPR-Cas9系统应用于棉花基因组编辑。以及通过诱导愈伤组织途径来检测sgRNA编辑效率奠定了实验基础,同时为利用CRISPR-Cas9系统定向诱变陆地棉(AADD)功能基因提供理论依据。
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