【摘 要】
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黄曲霉毒素B1(Aflatoxin Bi,AFBi)是由某些真菌菌株产生的次生代谢产物.由于其具有极强的毒性、致癌性以及在自然界存在的普遍性,可污染多种粮食作物,严重威胁消费者的健康.
【出 处】
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第五届中国兽药大会(中国畜牧兽医学会动物药品学分会2014年学术年会、中国畜牧兽医学会生物制药学分会暨中国微生物学会兽医
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黄曲霉毒素B1(Aflatoxin Bi,AFBi)是由某些真菌菌株产生的次生代谢产物.由于其具有极强的毒性、致癌性以及在自然界存在的普遍性,可污染多种粮食作物,严重威胁消费者的健康.因此,许多国家规定了AFBi在各类粮食、食品和饲料中的限量标准.研究准确、快速、灵敏的AFBi检测方法具有重要意义.传统的高效液相色谱法(HPIC)虽具有很高灵敏度和准确性,但仪器昂贵,并要求操作人员技术熟练,使其难以满足基层相关部门快速检测AFBi的要求.而ELISA法具有特异、灵敏、简单、经济、耗时短等优点.本研究成功制备了高亲和力的特异性AFBi单克隆抗体,建立了间接竞争ELISA(Ci-ELISA)检测AFBi的方法. 用N,N--环己基碳酰亚胺(DCC)法制备AFBl-BSA完全抗原并进行鉴定,然后对6-8周龄的BALB/C小鼠进行免疫,三免后取血清效价在1:10000以上的小鼠进行加强免疫,3天后进行细胞融合.用PEG将阳性小鼠的脾细胞与小鼠瘤细胞进行融合,融合成功后用间接ELISA筛选出产AFBi特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞.对特异性抗体进行亲和力常数的测定,然后用小鼠体内诱生腹水的方法大量制备单克隆抗体.用完全抗原AFBi-BSA进行固相包被,以含AFB1单抗的小鼠腹水作为一抗、AFBi标准品作为竞争抗原来构建AFBi的间接竞争ELISA检测方法.对抗原最佳包被时间、单抗最佳稀释倍数、竞争反应时间、竞争反应模式进行探索,优化的Ci-ELISA检测体系为:抗原包被浓度为0.3125ug/ml,单抗稀释倍数为1:512000由此构建成功的Ci-ELISA检测方法的线性范围为0.39-12.5ng/ml,相关系数R=0.9939.检测下限为0.52ng/ml,批内和批间平均变异系数分别为6.27％和6.14％,玉米中的平均加标回收率在80-!20％之间,变异系数均小于10％.
上述试验结果表明,获得的抗AFBi单克隆抗体亲和力良好,优化条件后构建的Ci-ELISA检测方法稳定、重复性良好,对人工污染的玉米样品检测结果表明该方法可以用于实际样品的检测.
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