60Coγ射线照射后人正常肝细胞子代的基因差异表达

来源 :首届全球华人辐射研究大会 | 被引量 : 0次 | 上传用户:gswwg
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  目的:利用基因芯片技术测定60Coγ-射线照射后的细胞子代基因谱改变,从中筛选辐射敏感标志物,为进一步研究辐射诱发的基因组不稳定的分子机制提供依据.方法:在含20%小牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中,于37℃、5% CO2条件下培养人正常肝细胞7702至对数生长期.取对数生长期的肝细胞,稀释到终浓度为1×05个/ml,在冰浴下用60Co辐照装置照射(剂量为2、4和6 Gy),未经照射细胞为对照组.取未照射组和照射组的细胞,经0.25%胰酶消化后,用RPM 1640培养基对其进行梯度稀释,将一定数量的细胞植入培养皿中,放入恒温培养箱中培养18天后将存活的细胞克隆移入培养瓶中继续传代培养.利用Illumina光纤微珠芯片对子代克隆细胞差异表达基因进行测定,同时选取HAVCR2、RAN两个差异表达基因,利用实时荧光定量PCR技术进行验证,最后进行生物信息学分析并构建相互作用网络图.结果:受照射后克隆存活细胞子代基因组的表达谱发生了改变.在所分析的48000个基因中,经2Gy照射的细胞出现了262个差异表达基因,其中上调的基因有130个,下调的基因有132个;4Gy照射组中,共有2746个差异表达基因,其中上调的基因有1282个,下调的基因有1463个;6Gy照射组中,共有3406个差异表达基因,其中上调的基因有1687个,下调的基因有1719个.上述三个剂量组与对照组细胞相比较,共同的差异表达基因有71个,其中上调的基因有35个,下调的基因36个.为了进一步验证基因芯片结果,选取2Gy、4Gy、6Gy受照射细胞克隆子代共有的两个差异表达基因HAVCR2、RAN进行荧光定量RT-PCR的测定,以管家基因β-actin为内参.结果显示,HAVCR2基因表达上调,其在2Gy、4Gy、6Gy组中的相对表达量分别为8.024、8.318、8.513,基因芯片的结果为21.4、48.13、52; RAN基因表达下调,其在2Gy、4Gy和6Gy组中的相对表达量分别为0.867、0.866、0.853,基因芯片的结果为-21.92、-29.59、-53.911;检测结果与芯片结果的趋势相一致.利用BioCata公共信号通路资源数据库和GeneSpring软件对三个剂量组共同差异表达的71个基因进行生物信息学分析,构建出了相互作用的网络图.结论:基因芯片技术在基因组水平上证实了辐射可诱发人肝细胞的基因组不稳定性,同时筛选出一批相关的差异表达基因,主要与细胞周期、细胞骨架和运动、细胞凋亡、细胞信号转导、DNA复制和修复等生物功能相关.生物信息学分析构建了差异表达基因相互作用的网络图,初步揭示了RAN、CDT1、IER3、V-FOS等基因在辐射诱发基因组不稳定性进程中可能的生物学作用.
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