【摘 要】
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目的:利用脂多糖(LPS)诱导体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)TLR4-MyD88炎症通路活化,建立热毒生风型络风内动细胞模型,为络风内动研究平台的科学化寻求新突破.方法:体外原代培养HCASMC,用MTT法检测不同浓度(O,0.01,0.1,0.5,1,5,10,100μg/ml)LPS对HCASMC活力的影响,筛选出HCASMC活力在98％以上的LPS无毒性浓度范围.用ELISA
【机 构】
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北京中医药大学东直门医院,北京中医药大学心血管病研究所,北京市东城区海运仓5号,100700
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目的:利用脂多糖(LPS)诱导体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)TLR4-MyD88炎症通路活化,建立热毒生风型络风内动细胞模型,为络风内动研究平台的科学化寻求新突破.
方法:体外原代培养HCASMC,用MTT法检测不同浓度(O,0.01,0.1,0.5,1,5,10,100μg/ml)LPS对HCASMC活力的影响,筛选出HCASMC活力在98％以上的LPS无毒性浓度范围.用ELISA法检测无毒性浓度范围内的LPS作用不同时间(6h,24h,48h)对细胞上清IL-6,TNF-α和IL-1β释放水平的影响,筛选出小范围LPS干预浓度和作用时间,继而用RT-PCR法对IL-6,TNF-α,IL-1β,TLR4,MyD88,NF-κB p65mRNA进行半定量检测,用Western blotting法检测TLR4,MyD88,NF-κB p65蛋白表达变化,确定最终造模条件.
结果:MTT示LPS在5μg/ml和100u g/m1浓度时细胞活力低于98％,其余浓度均可促进HCASMC生长,为下一步实验所需的无毒性浓度范围;ELISA结果显示0.5u g/ml和1μg/ml的LPS干预24h、48h都可显著诱导产生炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α(P＜O.05);RT-PCR及Western blotting结果显示1μg/ml的LPS作用48h可最大程度激活TLR4-MyD88炎症通路下游因子基因和蛋白表达.
结论:1μg/ml的LPS干预HCASMC48h可保证HCASMC处于持续的高炎性活化状态,可作为热毒生风型络风内动细胞模型的最佳造模条件.
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