论文部分内容阅读
目的：ARHI基因是一个母源性印迹基因,其编码的蛋白在人类多种组织中如卵巢、乳腺和胰腺中表达,但在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌中存在表达下调；研究发现,ARHI基因通过对Ras-Raf-MAPK-ERK、Ras-PI3K-AKT和JAK-STAT3信号通路中相关分子的抑制作用发挥抑制胰腺癌细胞增殖、促进凋亡、诱导自噬和凋亡的作用.本研究旨在通过稳定转染ARHI的细胞株和裸鼠胰腺癌荷瘤模型,探讨ARHI基因对胰腺癌血管生成的影响及相关机制.方法：1.应用携带ARHI基因的质粒pLNCX2-ARHI-EGFP和空载体质粒pLNCX2-EGFP,采用脂质体瞬时转染胰腺癌PANC-1细胞系,并用G418筛选建立稳定转染的多克隆细胞株.2.两组细胞通过RT-PCR和Western blot鉴定ARHI基因表达情况,用MTT法检测ARHI基因对胰腺癌细胞增殖的影响.3.通过Real-time PCR检测稳定转染pLNCX2-ARHI-EGFP的细胞和稳定转染pLNCX2-EGFP的细胞中mTOR、SOSC3、Stat3、NF-κB、VEGF、CXCL8 mRNA表达的影响.4.通过Western blot检测稳定转染pLNCX2-ARHI-EGFP的细胞和稳定转染pLNCX2-EGFP的细胞中mTOR、SOSC3、Stat3、NF-κB、CXCL8蛋白表达的影响.5.将稳定转染pLNCX2-ARHI-EGFP的细胞、稳定转染pLNCX2-EGFP的细胞和未转染的PANC-1细胞扩大培养,以1×107个细胞/200ul接种于裸鼠腋窝皮下,比较三组裸鼠体重变化、肿瘤重量和体积. 6.荷瘤标本一部分进行病理学检测,通过免疫组化检测ARHI、Ki-67、CD34、VEGF、CXCL8蛋白的表达；一部分标本通过Real-time验证ARHI基因对mTOR、SOSC3、Stat3、NF-κ B、VEGF、CXCL8 mRNA表达的影响.结果：1.G418筛选4周收集稳定转染胰腺癌细胞,稳定转染细胞株可见绿色荧光；2.通过RT-PCR和Western blot方法检测,在ARHI基因稳定转染组可见ARHImRNA和蛋白表达,而空载体和对照组无表达.3.MTT结果显示,稳定转染pLNCX2-ARHI-EGFP的多克隆细胞比稳定转染pLNCX2-EGFP的多克隆细胞株细胞增殖缓慢.4.稳定转染pLNCX2-ARHI-EGFP的多克隆细胞mTOR、Stat3、NF-κB、VEGF、CXCL8 mRNA表达比稳定转染pLNCX2-EGFP的多克隆细胞株细胞显著降低,SOCS3 mRNA表达显著升高；p-mTOR、p-Stat3、NF-κB、CXCL8蛋白表达显著降低. 5.接种后所有裸鼠均有一定程度的消瘦,pLNCX2-ARHI-EGFP组消瘦显著,肿瘤质量和体积显著偏小.6.pLNCX2-ARHI-EGFP组裸鼠荷瘤中ARHImRNA和蛋白表达阳性,pLNCX2-EGFP组和对照组无表达,证明胰腺癌荷瘤成功建立.7.pLNCX2-ARHI-EGFP组裸鼠荷瘤中Ki-67蛋白表达显著下降,MVD显著减少,VEGF和CXCL8蛋白表达显著下降.8.pLNCX2-ARHI-EGFP组裸鼠荷瘤中mTOR、Stat3、NF-κB、VEGF、CXCL8 mRNA表达显著下降,SOCS3 mRNA表达显著升高,与细胞结果一致.结论：ARHI基因抑制胰腺癌细胞株增殖,抑制胰腺癌裸鼠荷瘤的生长,抑制胰腺癌裸鼠荷瘤中血管生成和相关蛋白VEGF和CXCL8的表达.ARHI基因抑制肿瘤中血管生成和相关蛋白VEGF和CXCL8可能通过mTOR/NF-κ B和STAT3信号传导通路,进而抑制胰腺癌血管生成、生长和转移.