【摘 要】
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目的 建立lncRNA DBCCR1-003基因的CRISPR/Cas9敲除体系,方法 针对DBCCR1-003设计3个20bp的sgRNA(sp1、sp2和sp3)。与PX458载体连接,构建PX458-sgRNA敲除表达载体。通过T7E1实验评估敲除效率最高的sgRNA,并以其构建lentiCRISPRv2-sgRNA敲除表达质粒。包装病毒,将病毒上清液转染293T细胞,筛选后通过有限稀释法构
【机 构】
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广州医科大学附属第一医院,广东省泌尿外科重点实验室 中山大学附属第一医院,广州510230
【出 处】
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CUA2015全国泌尿男生殖系统肿瘤专题会议(10th)暨2015年广东省医学会泌尿外科学学术年会
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目的 建立lncRNA DBCCR1-003基因的CRISPR/Cas9敲除体系,方法 针对DBCCR1-003设计3个20bp的sgRNA(sp1、sp2和sp3)。与PX458载体连接,构建PX458-sgRNA敲除表达载体。通过T7E1实验评估敲除效率最高的sgRNA,并以其构建lentiCRISPRv2-sgRNA敲除表达质粒。包装病毒,将病毒上清液转染293T细胞,筛选后通过有限稀释法构建敲除DBCCR1-003基因的稳定细胞株,并以real-time PCR(RT-PCR)验证DBCCR1-003的表达量。结果 DBCCR1-003的3个靶序列均成功插入PX458表达载体中且测序正确,T7E1实验表明DBCCR1-003sgRNAsp1靶向敲除效率最高；成功构建lentiCRISPRv2-sgRNAsp1 DBCCR1-003稳定敲除细胞株；RT-PCR证实获得该细胞株中DBCCR1-003表达明显降低。结论 建立了能稳定敲除lncRNA DBCCR1-003基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统,为进一步研究DBCCR1-003基因功能奠定基础。
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