【摘 要】
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转基因作物商品化进程中,转基因作物的安全评估是亟待解决的关键问题,建立准确、方便和快速的转基因外源蛋白鉴定和检测方法意义重大.本实验克隆epsps基因并构建epsps-pET30a
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转基因作物商品化进程中,转基因作物的安全评估是亟待解决的关键问题,建立准确、方便和快速的转基因外源蛋白鉴定和检测方法意义重大.本实验克隆epsps基因并构建epsps-pET30a表达载体,表达纯化EPSPS融合蛋白,以该蛋白为免疫原,制备兔血清和小鼠单克隆抗体,进而进行棉花中转基因外源蛋白EPSPS检测方法(Sandwich ELISA)的建立和应用.实验结果表明:克隆得到1368 bp的epsps基因,将其与pET-30a连接构建得到重组表达载体epsps-pET30a,诱导表达得到54kD的EPSPS融合蛋白,以该蛋白为免疫原制得抗兔血清,效价达到1.6×104.制得小鼠单克隆抗体4E3,效价为2×104,属于IgG1类,轻链为κ型.基于EPSPS兔血清和单克隆抗体的Sandwich ELISA检测范围为1～100 ng·mL1.往大豆、棉子和空白提取液中添加EPSPS蛋白,以建立的Sandwich ELISA测定添加回收率,分别为75.2％～90.8％、74.4％～78.4％和84.3％～87.3％,变异系数在1.36％～4.48％、1.20％～3.84％和0.92％～5.36％.交叉反应率结果表明,所建立方法与其他常用转基因外源蛋白(CrylAc、2Aa、9C、CpTI、PAT)没有交叉反应.用Sandwich ELISA测定10个棉花品种中EPSPS的含量.A1-1,A2-1,A3-1,A4-1和A5 1中检测到EPSPS蛋白,A1-2,A2-2,A3-2,A4-2和A5-2五个品种检测不到EPSPS.将所建立的EPSPS Sandwich ELISA同国外商品化检测试剂盒进行比较,本实验建立的方法与比较方法的结果一致,且本方法得到纯化的标准蛋白,还可进行定量测定.
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