人工合成ASGNA的原核表达和抗虫性初探

• 作 者: 田莉莉;常淑芬;俞嘉宁;
• 机 构: 陕西师范大学生命科学学院,陕西 西安 710062
• 出 处: 中国棉花学会2013年年会
• 发表日期: 2013年期

本研究采用Over-lap PCR的方法人工合成了适合双子叶植物表达的新型雪花莲凝集素(ASG-NA)的全基因序列。该基因全长512 by，由105个氨基酸残基组成，成熟的GNA蛋白由同源四聚体组成，每个亚基大小为12. 5 kD。在此基础上将ASGNA连接到原核表达载体pET-28a上，构建原核重组表达载体pET-28a-ASGNA，经酶切鉴定和测序验证后将其转化至大肠杆菌BL21中。摇菌，破碎后进行SDS-PAGE电泳，结果显示，与空载pET-28a相比，在19. 5 kD处有目的条带，初步确定为为ASGNA蛋白。将pET28a- ASGNA菌和pET28a菌摇到ODs0。值为1. 0，使用超声波破碎细胞，离心，取上清，摘取新鲜野生型拟南芥叶片喷至滴水状态，晾干后，用软毛笔接种20只蚜虫幼虫在叶片上，每日定时更换叶片。以同期生长的野生拟南芥叶片喷pET28a破碎后的上清液为对照，连续观察一周(重复4次)，结果表明喷施含有ASGNA上清液的叶片具有抑蚜效果，平均抑蚜率12000取拟南芥植株中部相同大小的叶片，分别将喷pET28a破碎后的上清液的对照叶片和喷pET28a- ASGNA上清液叶片接上同日龄的母体蚜虫，每天观察统计母蚜产生的子代幼虫数目，直到母体蚜虫死亡(重复4次)。实验结果表明与对照植株相比，喷pET28a-ASGNA上清液能使蚜虫的繁殖力显著降低，下降约40000上述结果初步表明，人工合成的ASGNA基因对蚜虫的生长有抑制作用并且降低蚜虫繁殖能力，后续实验有必要对ASGNA蛋白进行分离纯化，以其饲喂蚜虫，同时结合转基因植株进行更深人的抗虫研究，为ASGNA基因在棉花中的应用奠定基础。