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目的：建立稳定抑制猪内源性逆转录病毒(porcine endogenousretrovirus,PERV)表达且不含PERV-C的猪成纤维细胞,为下一步培育更安全的转基因猪提供核供体细胞,从而解除异种器官和细胞在异种移植和生物人工肝应用中的PERV感染的风险。
方法：选择具有PERV低拷贝数且不含PERV-C的西藏小型猪,获取其成纤维细胞； 再利用RNA干扰技术,针对PERV高度保守的gag和pol区域,设计6对shRNA(gag1,gag2,gag3,poll,pol2,pol3)和2对阴性对照(negmive control,NC)(gag-NC,pol-NC),进行化学合成,通过转染稳定表达PERV的HEK293细胞,利用Real time RT-PCR、Western blot analysis和细胞免疫化学评价PERV在mRNA和蛋白水平的表达情况,筛选出能够抑制PERV表达最为有效的short hairpin RNA(shRNA)片段,并利用逆转录病毒表达载体pSuper-retro-GFP/neo作为shRNA的表达载体系统。将该片段导入西藏小型猪成纤维细胞,抑制该细胞中PERV表达,建立稳定表达shRNA的猪成纤维细胞,并再次验证PERV在该细胞中mRNA和蛋白水平的表达情况。
结果： 我们发现shRNA-pol3是抑制PERV表达最为有效的片段； 获得稳定表达shRNA-pol3的西藏小型猪成纤维细胞与猪胚肾细胞株PK15和野生型的西藏小型猪成纤维细胞相比,PERV mRNA表达量仅约10％,PERV P15E蛋白表达也显著下降。
结论：本研究获得的稳定表达shRNA的西藏小型猪成纤维细胞具有较前更低的PERV拷贝数,且没有PERV-A/C感染的风险,可以作为下一步培育更为安全的稳定表达shRNA的转基因猪的核供体细胞。
方法：选择具有PERV低拷贝数且不含PERV-C的西藏小型猪,获取其成纤维细胞； 再利用RNA干扰技术,针对PERV高度保守的gag和pol区域,设计6对shRNA(gag1,gag2,gag3,poll,pol2,pol3)和2对阴性对照(negmive control,NC)(gag-NC,pol-NC),进行化学合成,通过转染稳定表达PERV的HEK293细胞,利用Real time RT-PCR、Western blot analysis和细胞免疫化学评价PERV在mRNA和蛋白水平的表达情况,筛选出能够抑制PERV表达最为有效的short hairpin RNA(shRNA)片段,并利用逆转录病毒表达载体pSuper-retro-GFP/neo作为shRNA的表达载体系统。将该片段导入西藏小型猪成纤维细胞,抑制该细胞中PERV表达,建立稳定表达shRNA的猪成纤维细胞,并再次验证PERV在该细胞中mRNA和蛋白水平的表达情况。
结果： 我们发现shRNA-pol3是抑制PERV表达最为有效的片段； 获得稳定表达shRNA-pol3的西藏小型猪成纤维细胞与猪胚肾细胞株PK15和野生型的西藏小型猪成纤维细胞相比,PERV mRNA表达量仅约10％,PERV P15E蛋白表达也显著下降。
结论：本研究获得的稳定表达shRNA的西藏小型猪成纤维细胞具有较前更低的PERV拷贝数,且没有PERV-A/C感染的风险,可以作为下一步培育更为安全的稳定表达shRNA的转基因猪的核供体细胞。