【摘 要】
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目的：设计并筛选人IGF-Ⅰ有效RNA干扰片段,构建IGF-Ⅰ-siRNA慢病毒表达载体.方法：对人IGF-Ⅰ基因编码区分析、筛选序列4条,阴性对照序列1条.与pGCL-GFP质粒重组后,转染大肠杆菌感受态细胞.阳性克隆经过鉴定后得到正确重组子,制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒,共转染293T细胞,体外直接感染表达IGF-I的人血管平滑肌细胞.通过用Realtime-P
【机 构】
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the First associated hospital of Chinese PLA General hospital,Beijing China 100048
【出 处】
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2013北京协和急诊医学国际高峰论坛
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目的：设计并筛选人IGF-Ⅰ有效RNA干扰片段,构建IGF-Ⅰ-siRNA慢病毒表达载体.方法：对人IGF-Ⅰ基因编码区分析、筛选序列4条,阴性对照序列1条.与pGCL-GFP质粒重组后,转染大肠杆菌感受态细胞.阳性克隆经过鉴定后得到正确重组子,制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒,共转染293T细胞,体外直接感染表达IGF-I的人血管平滑肌细胞.通过用Realtime-PCR检验干扰效果.结果：1、成功地合成四条编码发夹siRNA序列的单链DNA,并将其克隆到pGCSIL-GFP载体中,构建重组质粒PscSl-1,2,3,4及无关基因的重组质粒PSC-NC,酶切鉴定和测序证实载体构建成功.2、Real time-PCR检测IGF-I的mRNA表达,发现重组质粒PscSI-1转染人血管平滑肌细胞后IGF-I mRNA表达最低,重组质粒PSC-NC转染组细胞内IGF-ImRNA的表达量与空白对照的水平接近(P>0.05).结论：1、成功构建了小的发夹式IGF-I慢病毒表达载体.2、在人IGF-I序列位点1010～1028bp、序列为ACCTTGTCTAAGTGGTTTA可以在人血管平滑肌细胞中实现对人IGF-I基因表达的有效沉默.
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