【摘 要】
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生防蜡样芽孢杆菌905(Bacillus cereus905)是本实验室从小麦体内分离获得的一株有益芽孢杆菌,温室和田阃应用结果显示.该细菌在小麦、水稻等很多作物上都表现出促生和防病效果,能在小麦根际稳定定殖.本实验室前期研究发现B.cereus 905的细胞破碎液中含有大量的SOD.当sodA(Mns0D的编码基因)缺失突变后.B.cereus 905在小麦根围的定殖能力与野生型菌株相比急剧下降
【机 构】
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中国农业大学植物病理学系,农业部植物病理学重点开放实验室,北京,100193
【出 处】
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中国植物病理学会第十届青年学术研讨会
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生防蜡样芽孢杆菌905(Bacillus cereus905)是本实验室从小麦体内分离获得的一株有益芽孢杆菌,温室和田阃应用结果显示.该细菌在小麦、水稻等很多作物上都表现出促生和防病效果,能在小麦根际稳定定殖.本实验室前期研究发现B.cereus 905的细胞破碎液中含有大量的SOD.当sodA(Mns0D的编码基因)缺失突变后.B.cereus 905在小麦根围的定殖能力与野生型菌株相比急剧下降.说明SOD与有益菌B.cereus 905在小麦根围的定殖能力密切相关.在纳米二氧化钛(TiO2)光催化氧化胁迫下.sdA缺失突变体存活能力相对于野生型B.cereus 905显著下降,功能互补sodA后能突变株的存活能力恢复到野生型水平,深入研究发现B.cereus 905 soda的表达水平在TiO2光催化氧化胁迫下显著提高,表明MnSOD在B.cereus 905抵御纳米TiO2光催化氧化毒性过程中起重要作用.目前对B.cereus 905定殖的分子机制还仅局限于对SOD的研究.其它方面尚不清楚.转座子标签技术是研究功能基因的有效的工具之一,因此,本研究将构建B.cereus 905转座子随机插入突变体库,为深入研究B.cereus 905定殖的分子机制奠定基础.pMarA转座质粒具有高效和稳定的优点,目前已经成功用于枯草芽孢杆菌,苏云金芽孢杆菌插入突变体库的构建.pMarA是一个大小为8253 bp的转座质粒.其上舍有转座子ThYLB-1和温度敏感型复制子repG+tm(30℃复制,50℃不能复制).在低温条件下,pMarA上的Himatl在启动子PA作用下表达,识别转座子ThYLB-1(KanR)两端的反向重复序列ITR,使转座子从pMaxA质粒上跳跃到B.cereus 905基因组上；由于repG+tm复制子不能复制,在高温条件下.未发生转座的pMarA(ErmR,KanR)将被消除；因此转座子成功插入到基因组上的菌株对卡邢霉素具有抗性,而对红霉素敏感(ErmS,KdnR).本实验中,将带有pMarA的B.cereus 905接种至LB培养液中,37℃振荡培养12 h,诱导TnYLB-1发生转座；取合适菌液稀释LB涂板(无抗性).46℃高温培养8 h,挑取长出的单菌落,同时点接至LB(Kan,50ug/mL)平板和LB(Erill,10ug/mL)平板上,30℃培养过夜；挑取具有卡那霉素抗性而对红霉素敏感的单菌落至LB(Kan,50ug/mL)平板上保存备用,这些菌株即为插入突变子.实验结果显示,pMarA在B.cereus905中的转座效率为9.8×10-3,比报道的其在枯草芽孢杆菌中的转座效率高.随机挑取15个单菌落,提取基因组,用EcoRI酶切12h,进行SOUtl[1ernbIot分析,结果显示80％的突变子是转座子单位点插入基因组中；从中挑取了7个菌落.提取基因组,进行采用反向PCR及测序技术检测插入住点,测序结果显示插入住点的序列均不同,表明TnYLB-1转座子的插入为随机插入.以上结果表明,利用37℃诱导转座,46℃消除质粒技术使转座子TnYLB-1转座子随机插入到B.cereus 905基因组上,成功构建了B.cerells905的转座子插入突变体库.B.cereus 905突变体库的建立,不仅有助于揭示B.cereus 905定殖的分子机制.而且有助于探索提高B.cereus 905生防效果的途径.
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