【摘 要】
：
目的：建立稳定表达野生型GPⅡb/Ⅲa和突变型GPⅡb/ⅢaT1565C的中国仓鼠卵巢(Chinese hamsterovary，CHO)细胞系,探讨GPⅢaT1565C点突变在细胞信号转导磷酸化中的作用。方法：从人红白血病(human erythroleukemia，HEL)细胞中提取人基因总RNA，通过RT-PCR扩增出GPⅡb、GPⅢa和GPⅢaTl565C基因。将PCR产物与质粒pcDNA
【机 构】
：
黑龙江省医院检验科 150036 哈尔滨医科大学附属第二医院检验科 150086
【出 处】
：
2009年全国微循环与血液流变学基础研究及临床应用学术研讨会
论文部分内容阅读
目的：建立稳定表达野生型GPⅡb/Ⅲa和突变型GPⅡb/ⅢaT1565C的中国仓鼠卵巢(Chinese hamsterovary，CHO)细胞系,探讨GPⅢaT1565C点突变在细胞信号转导磷酸化中的作用。
方法：从人红白血病(human erythroleukemia，HEL)细胞中提取人基因总RNA，通过RT-PCR扩增出GPⅡb、GPⅢa和GPⅢaTl565C基因。将PCR产物与质粒pcDNA3.1(+)酶切(Hind Ⅲ和NheⅠ)、连接、转化，构建出真核表达载体pcDNA3.1(+)Ⅱb、pcDNA3.1(+)Ⅲa和pcDNA3.1(+)ⅢaT1565C。采用脂质体介导基因转移法将构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)Ⅱ b与pcDNA3.1(+)Ⅲa或pcDNA3.1(+)ⅢaTl565C共转染到CHO细胞中，经G418筛选出稳定表达野生型GP Ⅱb/Ⅲa和突变型GPⅡb/IHaT1565C的CHO细胞系。流式细胞术(floweytometry,FCM)检测野生型和突变型GPⅡb/ⅢaCHO细胞表面CD41和CD61的表达。免疫沉淀、免疫印迹(Western blot)和FCM细胞内染色等方法检测野生型和突变型GPⅡb/Ⅲa CHO细胞经纤维蛋白原(fibrinogen，Fbg)激活后发生的粘着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)酪氨酸磷酸化和丝氨酸磷酸化。
结果：成功获得GP Ⅱ b、GpⅢa和GPⅢaT1565C基因及其真核表达载体。pcDNA3.1(+)ⅢaT1565C经酶切、PCR和测序分析,除引入突变位点产生预期T1565C突变外,其余碱基序列无改变。FCM检测野生型和突变型GP Ⅱ b/Ⅲa CHO细胞其表面CD41和CD61均高效表达，分别为97.19％和99.71％。免疫沉淀、Western blot检测野生型和突变型GPⅡb/ⅢaCHO细胞经Fbg激活90min分别有16.24％和20.44％的FAK发生酪氨酸磷酸化；FCM细胞内染色检测其经Fbg激活90min不发生FAK丝氨酸磷酸化,激活48h分别有34.89％和73.84％发生FAK丝氨酸磷酸化。
结论：成功构建稳定表达野生型GPⅡb/Ⅲa和突变型GPⅡb/ⅢaT1565C的CHO细胞系。GPⅢaT1565C点突变能够增强细胞内信号转导关键成分FAK酪氨酸磷酸化和丝氨酸磷酸化，进而增强GPb/Ⅲa介导的细胞外向内信号转导功能。
其他文献
适度训练有益身心健康，过度训练可引起机体的损伤。过度训练是由于运动训练负荷过大,超过机体的承受能力，导致多器官功能紊乱的病理状态。目前尚无有效的防治措施。本文介绍了近年来国内外过度训练研究的动态、主要进展和问题，提出了未来展望。
随着人们对多器官功能障碍综合征(multiple organdysfunction syndrome，MODS)以及多器官衰竭(multiple organ failure，MOF)发病机制研究的深入，认识到除与失控的全身炎症反应、器官微循环障碍等环节有关外，肠道屏障功能障碍致肠道细菌/内毒素移位(bacteria/endotoxintranslocation，BET)所引起的肠源性感染，是多器官
目的：探讨中国哈尔滨地区汉族人群磷酸二酯酶4D基因单核苷酸多态性(single nucleotide pol-ymorphism SNP)87和SNP83与脑卒中之间的关系。方法：采用多重聚合酶链高温连接酶检测反应(PCR--LDR)，对哈尔滨地区122例脑卒中患者及44例对照者磷酸二酯酶4D基因单核苷酸多态性进行检测,并比较各组间等位基因及基因型频率分布的差异。结果：SNP87基因型频率在脑卒中
目的：为制定中国青年男性红细胞计数正常参考值的统一标准提供科学依据。方法：收集了中国334个单位用显微镜计数法测定的41759例青年男性红细胞计数正常参考值,运用曲线回归分析的方法，研究了其与海拔高度之间的关系。结果：发现随着海拔高度的逐渐增大，青年男性红细胞计数正常参考值按指数规律也在逐渐的增大，相关性很显著(R=0.879，F=1133.33,P=0.0000)；推导出了一个指数曲线模型：Y=
目的：评价同型半胱氨与高敏C反应蛋白联合检测在冠状动脉粥样硬化患者诊断中的作用。方法：研究对象为老年病科379例CAS患者，应用Bade BehringBNP系统测量患者的HCY与hsCRP水平,并设健康体检者做对照组。结果：健康对照组HCY与hsCRP均无显著增高，患者组HCY水平增高237例，hsCRP增高243例，二者均增高169例。结论：HCY与hsCRP联合检测可以提高冠状动脉粥样硬化评
目的：为制定中国青年女性红细胞计数正常参考值的统一标准提供科学依据。方法：收集了中国321个单位用显微镜计数法测定的38263例青年女性红细胞计数正常参考值，运用曲线回归分析的方法，研究了其与海拔高度之间的关系。结果：发现随着海拔高度的逐渐增大，青年女性红细胞计数正常参考值按指数规律也在逐渐的增大，相关性很显著(R=0.888，F=1193.69，P=0.0000)；推导出了一个指数曲线模型：Y=
目的：观察补肾益气活血方对胎儿生长受限(FGR)孕鼠胎盘病理变化及其细胞凋亡的影响,探讨该方治疗FGR的机制。方法：采用被动吸烟法建立大鼠FGR模型，将32只孕鼠随机分成四组，正常组、模型组(FGR组)、中药组(补肾益气活血方治疗组)、西药组(精氨酸治疗组)。运用HE染色法观察各组胎盘的病理变化及TUNNEL，法检测胎盘细胞的凋亡。结果：FGR胎盘绒毛内有血液淤积及缺血样改变。中药可明显改善胎盘微
目的：探讨红外线对慢性萎缩性胃炎(CAG)大鼠胃黏膜及血液流变恢复的影响的影响。方法：将30只成年雄性Wistar大鼠随机分成正常组、模型组及红外治疗组。应用2％水杨酸钠和30％酒精的混合溶液灌胃8周，刺激大鼠胃黏膜，并结合劳累、饥饱失常等多因素方法建立大鼠CAG模型。红外线治疗采用220V，200W的红外线灯，垂直照射大鼠胃部投影区，每日1次，每次10min，连续照射20d。光镜下观察胃黏膜厚度
目的：探讨动脉硬化性脑梗塞患者血液流变学和血脂指标异常特征及马来酸桂哌齐特合用脑蛋白水解物对动脉硬化性脑梗塞的治疗作用。方法：将72例动脉硬化性脑梗塞患者随机分为治疗组37例，对照组35例。另选36名健康老年人作对照。治疗前,两组病人均先检测血液流变学及血脂。两组均予以常规治疗，对症治疗及防治并发症。治疗组在常规治疗基础上,加用马来酸桂哌齐特注射液240mg加入5％葡萄糖液250ml或0.9％氯化
目的：探讨注射用七叶皂苷钠对脑出血急性期患者的神经保护作用和超敏C反应蛋白水平变化的影响。方法：65例患者随机分为对照组(32例)与治疗组(33例)。对照组给予常规治疗，治疗组在常规治疗基础上加用注射用七叶皂苷钠.均治疗2周。观察两组治疗前后神经功能缺损程度、脑水肿变化及hs-CRP水平变化情况。结果：治疗后两组的水肿强度都升高，但治疗组升高程度较对照组低,治疗前后水肿增加的差值有显著性差异(P<