【摘 要】
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目的：构建自噬相关基因Beclin1 基因慢病毒过表达载体,并用该载体转染类风湿关节炎滑膜细胞(RASF),构建Beclin1 基因过表达的RASF细胞株,探讨Beclin1基因过表达,对在甲氨蝶呤(MTX)作用下,RASF细胞增殖凋亡的影响.方法：聚合酶链反应扩增目的基因Beclin1 后,插入慢病毒表达载体pHBLV-CMVIE-ZsGreen-T2A-puro中,构建重组载体pHBLV-Be
【机 构】
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西安交通大学附属红会医院 骨坏死与关节重建病区
【出 处】
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中华医学会第十八届骨科学术会议暨第十一届COA国际学术大会
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目的：构建自噬相关基因Beclin1 基因慢病毒过表达载体,并用该载体转染类风湿关节炎滑膜细胞(RASF),构建Beclin1 基因过表达的RASF细胞株,探讨Beclin1基因过表达,对在甲氨蝶呤(MTX)作用下,RASF细胞增殖凋亡的影响.方法：聚合酶链反应扩增目的基因Beclin1 后,插入慢病毒表达载体pHBLV-CMVIE-ZsGreen-T2A-puro中,构建重组载体pHBLV-Beclin1.将重组体转入大肠杆菌DH5α感受态细菌,筛选出含有正确插入片段的阳性克隆,使用聚合酶链反应、双酶切和DNA的测序方法对其进行鉴定.用重组载体与助转剂Polybrene共同转染经过纯化培养的人来源的RASF细胞,通过免疫荧光、WesternBlot等方法检测经过pHBLVBeclin1转染后,RASF细胞中Beclin1基因的表达情况.通过MTT、流式细胞术等方法,检测在MTX作用下,Beclin1基因过表达,对RASF细胞生长、凋亡的影响.结果：聚合酶链反应鉴定结果显示扩增的阳性片段已插入pHBLV-CMVIE-ZsGreen-T2A-puro载体,聚合酶链反应、双酶切和DNA测序结果表明,重组慢病毒载体pHBLV-Beclin1的插入序列完全正确.用重组慢病毒载体pHBLV-Beclin1感染人来源的RASF细胞,96h后荧光显微镜下可见细胞表达出明亮的绿色荧光,经过两次筛选、纯化,所有RASF均表达明亮的绿色荧光.WesternBlot检测,转染后pHBLV-Beclin1、pHBLV-non、空白对照组3组Beclin1/β-actin的灰度比值分别为1.56±0.24、0.79±0.12、0.82±0.09,pHBLV-Beclin1组较其他两组Beclin1表达显著增高(P＜0.05),pHBLV-non和空白对照组相比,差别无统计学意义.MTT测试显示,pHBLV-Beclin1组较空白对照组与pHBLVnon组,细胞增殖速度更快(P＜0.05),pHBLV-non组与空白对照组相比,增殖速度差别无统计学意义.经流式细胞术检测,pHBLVBeclin1组、pHBLV-non组与空白对照组3组细胞在MTX作用下,48h凋亡率分别为：6.7％、15.9％、16.3％.pHBLV-Beclin1组凋亡率较另外两组有明显降低(P＜0.05).结论：实验成功构建了自噬相关基因Beclin1 基因慢病毒过表达载体.在MTX作用下,Beclin1基因过表达的RASF细胞体现出更强的耐药性和抗凋亡能力.Beclin1的高表达,可以提高RASF细胞自吞噬水平,细胞通过自吞噬,消除自身损坏的细胞器,并将其转化为合成代谢所需要的原料,维持细胞生存,避免细胞进入不可逆的凋亡过程.
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