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本研究利用前期获得柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)一个仅在子孢子阶段高表达的EST序列(克隆号：ZBl-H07,Genbank登录号：ES351365.1),该序列编码的蛋白与刚地弓形虫的钙依赖蛋白激酶有很高同源性.通过RACE技术克隆扩增获得了该基因含一个完整开放阅读框的cDNA序列,全长1637 bp,包括一个276 bp的5-非翻译区(UTR)、一个59 bp的3-UTR和一个1302 bp的开放阅读框(ORF),编码433个氨基酸,预测分子量为49.26 kDa.根据氨基酸序列推测该蛋白具有钙依赖蛋白激酶的典型结构域,包括非常保守的N-端激酶结构域和C-端4个与Ca2+结合的EF手性结构,将该基因命名为E.tenella钙依赖蛋白激酶3(EtCDPK3,Genbank登录号：JQ679091).利用定量PCR对EtCDPK3基因在虫体不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)的转录表达进行分析,结果mRNA转录在子孢子阶段最高.将该基因连接到原核表达载体pET28a(+),诱导表达获得了重组融合蛋白rEtCDPK3,用获得的重组蛋白免疫兔获得兔抗rEtCDPK3的多克隆抗血清.Western blot分析显示制备的兔抗rEtCDPK3多克隆抗血清能识别大约49 kDa的虫体天然蛋白,且蛋白的表达在子孢子阶段高于其他3个阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊和裂殖子),未孢子化卵囊阶段蛋白几乎不表达.利用间接免疫荧光抗体标记技术对EtCDPK3在E.tenella体外感染DF-1细胞后不同发育阶段虫体的分布进行分析,结果发现在第一代裂殖生殖过程中该蛋白分散在整个虫体中,且荧光强度随着虫体在细胞内的发育逐渐加强,早期子孢子入侵DF-1细胞后该蛋白主要位于子孢子的顶端,且表达增加.为了进一步验证该蛋白是否参与虫体入侵细胞,利用兔抗rEtCDPK3特异性抗体进行了体外抑制试验,结果显示特异性抗体与子孢子孵育后,子孢子入侵DF-1细胞的能力减弱.这些结果表明EtCDPK3可能参与了虫体对宿主细胞的入侵以及虫体在宿主细胞内的生长发育,而宿主体内缺乏钙依赖蛋白激酶,因此EtCDPK3分子将来很可能成为球虫病防治的新治疗药物靶标和研制新型疫苗的靶分子.