【摘 要】
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目的 肝癌是发病率与致死率极高的恶性肿瘤[1,2].射频消融是治疗肝癌的常用根治性治疗方法 ,但射频术后肿瘤复发率较高.本课题组前期研究表明,消融过渡区内亚致死性热温度(42～60℃)未能将肝癌细胞杀灭,经历热刺激后的肝癌细胞内长链非编码RNA 表达谱发生明显变化[3].其中LncRNA RNU12 在热处理前后差异显著,功能实验初步表明其可通过上调热休克蛋白72抑制重组人TRAIL 蛋白促肝癌细
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目的 肝癌是发病率与致死率极高的恶性肿瘤[1,2].射频消融是治疗肝癌的常用根治性治疗方法 ,但射频术后肿瘤复发率较高.本课题组前期研究表明,消融过渡区内亚致死性热温度(42～60℃)未能将肝癌细胞杀灭,经历热刺激后的肝癌细胞内长链非编码RNA 表达谱发生明显变化[3].其中LncRNA RNU12 在热处理前后差异显著,功能实验初步表明其可通过上调热休克蛋白72抑制重组人TRAIL 蛋白促肝癌细胞凋亡[4].本研究拟采用cDNA 末端快速扩增(RACE)技术获得RNU12 基因的cDNA 序列并进行初步分析,为下一步明确其具体作用机制奠定基础.方法 水浴加热法(50℃ 10min)处理肝癌细胞MHCC97-H,继续培养24h 后抽提与纯化细胞RNA.以上述RNA 为模板,采用LA Taq 酶合成第一条链cDNA,再以第一条链cDNA 为模板,经巢氏PCR的方法合成RNU12 的3末端和5末端.3RACE 步骤：以3adaptor 为反转引物的cDNA 为模版,巢氏PCR 两轮循环分别33 次.PCR 产物在琼脂糖凝胶中跑DNA 电泳,产物胶回收测序.5RACE 步骤：以特异性引物反转,得到cDNA,经RNase H 和TdT 处理后,进行巢氏PCR,回收产物并电泳.将回收纯化的目的产物连接到pMD18-T 载体,用连接产物转化感受态细胞.以pMD18-T载体上的通用引物做PCR,挑选阳性克隆送检测序.将中间序列及RACE 实验得到的序列进行拼接,得到基因的全长序列.最后,利用ORF finder 和Coding potential calculator 进行编码能力预测.结果 35RACE 实验初步确定LncRNA RNU12 全长1043bp,含22 个A 的poly-A 尾,并克隆获得其全长转录本.ORF finder 结果 显示在正链上预测出4 个开放阅读框(ORF),最长有编码 98 个氨基酸的序列,说明其可能具有编码蛋白的能力.但通过查询Coding potential calculator,其正义链得到noncoding(weak)的结论 ,其ORF 并不可靠.结论 本研究扩增出LncRNA RNU12 全长,有利于明确其在消融过渡区中发挥的作用及具体机制,对研究肝癌射频术后复发具有重要价值.ORF finder 和Coding potential calculator 预测结果 则相反,其实际是否具有编码蛋白能力需进一步研究加以明确.
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