【摘 要】
：
[目的]棉铃虫是许多农作物的一种主要害虫,其对有机磷、拟除虫菊酯类杀虫剂已产生较严重的抗药性.棉铃虫体内的CarE001C基因编码一种非特异性羧酸酯酶,前期利用真核表达
【机 构】
：
西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100
论文部分内容阅读
[目的]棉铃虫是许多农作物的一种主要害虫,其对有机磷、拟除虫菊酯类杀虫剂已产生较严重的抗药性.棉铃虫体内的CarE001C基因编码一种非特异性羧酸酯酶,前期利用真核表达系统研究表明其表达产物对杀虫剂具有代谢活性.但真核表达系统具有成本高、试验操作复杂的缺点,本研究旨在利用原核表达系统表达该基因、分离纯化目的蛋白,研究表达产物对杀虫剂的代谢活性.[方法]利用双酶切和T4 DNA连接酶将CarE001C与表达载体pET30a连接,转化表达菌株E.coli BL21 (DE3)后在低温(18℃)条件下通过异丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)诱导酯酶表达,利用Ni+-NTA柱对原核表达产物进行纯化,通过SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白,最后采用酶标仪测定其对α-乙酸萘酯(α-NA)的酶活,通过高效液相色谱(HPLC)仪测定其对β-氯氰菊酯的代谢活性.[结果]经0.2 mM IPTG诱导表达表达48 h后,SDS-PAGE电泳分析在66 kD大小位置,出现一条特异性蛋白质条带,Westem Blot验证表明该条带即目标蛋白条带；活性测定表明纯化的表达产物对α-乙酸萘酯具有较高活性,最大反应速率(Vmax)为67.72 nM/min、酶促反应亲和系数(Km)为144.53μM/L、酶促反应常数(kcat)和速率常数(kcat/km)分别为0.5154m in-1、0.0037 μM-1·min-1·L；其对β-氯氰菊酯代谢活性别为0.608 nM/min/mg.[结论]上述试验结果表明,羧酸酯酶CarE001C在原核系统表达后,获得具有一定生物活性的表达产物,其对杀虫剂有代谢活性,这为深入研究羧酸酯酶在棉铃虫对菊酯类杀虫剂代谢抗性产生中的作用及分子机制奠定了一定基础.
其他文献
[目的]昆虫围食膜是昆虫抵御随食物摄入的病原微生物入侵的第一道天然保护性屏障，近年来对围食膜蛋白的分离与鉴定及其与昆虫对病原微生物产生抗性的关系等方面的研究已成
为研究细胞色素P450基因在豌豆蚜脂类代谢中的作用,采用同源比对的方法从NCBI中BLAST到一条豌豆蚜P450基因cDNA序列 (登录号为XM 001944170.3),根据其结构特征被命名为cy
[目的]为了研究大豆蚜Aphis glycines在高温或吡虫啉的胁迫下,参与应激自我保护的热休克蛋白(HSPs)中的hsp70和hsc70在转录表达上的差异,进而寻找自我保护应激反应中的薄
[目的]为了更好地了解性信息素结合蛋白(pheromone binding proteins,PBPs)在桃蛀螟Conogethes punctiferalis(Guenée)嗅觉识别过程中的作用,明确其与配体化合物的结合
亲免素是高度保守、广泛分布的多功能蛋白家族,目前已发现几十种蛋白家族成员,亲环素蛋白家族的共同特征是其核心结构域中具有肽脯氨酰顺/反异构酶(peptidylprolylcistra
[目的]热激蛋白(HSP)是生物体应对高温或其它环境胁迫时所产生的一类特定的应急蛋白,其表达和调控是生物体对内外环境胁迫条件产生应激反应达到自我保护的重要基础,在不
为筛选出瓜实蝇雌成虫在高温胁迫下在实时荧光定量PCR中表达稳定的内参基因.本文基于实时荧光定量PCR技术测定了瓜实蝇雌成虫GAPDH、SD、β-TUB、ACT和RPL13共5个备选内
亲环素D(Cyclophilin D,CypD)是定位于线粒体膜上的亲免素家族成员,与腺嘌呤核苷酸转位蛋白(ANT)、电压依赖性阴离子通道(VDAC)、ATP合酶(F1Fo-ATPase)等多个组件组成线
利用RACE-PCR方法,扩增得到编码美国白蛾Hyphantria cunea Drury几丁质脱乙酰酶基因HcCDA2a.将该基因分别在大肠杆菌BL21和昆虫细胞BTI-Tn-5B1-4 (HighFive)中表达.经诱
[目的]小菜蛾Plutella xylostella L.属鳞翅目菜蛾科，是为害十字花科蔬菜的世界性大害虫，严重时害虫小菜蛾造成的产量损失可高达30％以上.华南地区十字花科蔬菜长年种植，小菜