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蝴蝶兰(Phalaenopsis)素有“洋兰皇后”的美誉，但现今的扩繁技术远无法满足市场需求，而组织培养中的褐变问题严重影响了快速繁殖的成功率。普遍认为，苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)等参与褐变过程。前期研究发现，POD和PPO的活力在接种后都有显著增加，特别是离体培养3d后，而PAL，酶活随着褐变加剧而增加，因此推断前者参与褐变的启动，后者与褐变进程相关。获取外植体的剪切过程引起外植体氧化爆发，从而引起组织内ROS水平失衡，有可能引发组织褐变，并最终导致细胞死亡。本研究以蝴蝶兰叶片在褐变加重(儿茶酚处理)和减轻(柠檬酸处理)处理情况下，分析外植体褐变细胞内ROS水平变化。结果显示，0.3g/L儿茶酚处理的蝴蝶兰叶片外植体离体培养3d，超氧阴离子水平明显低于对照(新鲜叶片为材料)，过氧化氢含量略高于对照；0.1g/L柠檬酸处理的蝴蝶兰叶片外植体离体培养3d，超氧阴离子水平低于对照，过氧化氢含量与对照没有明显差异。根据百草枯促进外植体组织过氧化和叠氮钠抑制外植体组织过氧化，控制细胞内ROS水平，我们考察蝴蝶兰叶片外植体褐变发生情况。蝴蝶兰叶片离体培养3d，对照组、百草枯处理和叠氮钠处理的褐变率分别为96.3％、100％和86.67％；在离体培养的前3d内，POD的酶活分别在1.5d、ld和2d达到最大值，PPO的酶活的最大值出现在离体培养0d，0.5h后同落，对照组在1d达到次峰值，而后缓慢下降，百草枯处理组和叠氮钠处理组在1.5d达到次峰值，在3d再上升，前者酶活较后者低。表明褐变程度影响蝴蝶兰叶片外植体ROS含量，内源ROS水平与褐变开始时间呈正相关。组织褐变最终引起组织细胞死亡，本研究对褐变过程进行了更细致深入的探讨；光镜下，可见蝴蝶兰叶片只有海绵组织，有“8”字型的大维管束和“0”字型的小维管束，胞内叶绿体大而丰富，有部分紫红色的色素细胞分布在表皮，新鲜切下的叶薄片可见细胞间隙偶尔出现黑色积聚物，经改良苯酚品红或DAPI染色，可见细胞核结构紧密，核内可见数颗深色物。观察离体培养3d和6d的叶片外植体，细胞间隙和维管束内的黑色积聚物逐渐增多，叶绿体先是颜色褪去，继而解体成碎片，细胞核变大，但染色变浅，核内深色物变多变小，6d时观察到核形状不规则，甚至核膜破裂，核内物质外溢。再观察离体培养更长时间的叶片外植体，发现外植体的切口处积聚大量絮状深褐色物质，往内观察，可见细胞发生严重的质壁分离，膜内充满褐色物质，再往内，部分细胞只剩下黑褐色的细胞壁，外植体中央部分细胞黑褐色的细胞壁内有大量解体的叶绿体。提取褐变组织总DNA电泳，发现DNA有明显的弥散状降解。初步推测，褐变组织的死亡原因为坏死。