【摘 要】
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目的：应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除小鼠编码T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因,构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠.
方法：根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因
【机 构】
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第四军医大学实验动物中心,西安,710032
【出 处】
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第十五届中国西部实验动物管理与学术交流会
论文部分内容阅读
目的：应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除小鼠编码T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因,构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠.
方法：根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列,分别针对其外显子设计25bp左右的sgRNA,化学合成sgRNA寡核苷酸序列,退火后克隆入PX330载体.Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞,受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠,首建鼠(F0)与野生型小鼠交配获得F1小鼠.通过基因测序、流式细胞术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型.
结果：成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录,mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠.序列分析表明F0代中有7只小鼠Rag2、IL2rg基因发生缺失突变;与野生型BALB/c小鼠相比,小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低.接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后,肿瘤生长良好,且随着时间延长肿瘤组织不断增大.
结论：利用CRISPR/Cas9技术可有效实现BABL/c小鼠体内Rag2、IL2rg基因突变,并导致小鼠T、B及NK细胞功能异常.
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