论文部分内容阅读
目的 ①对比小鼠外周血和骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)的分离培养方法及生物学特性,并探讨重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)对外周血MSCs的动员反应.②探索低强度脉冲超声(LIPUS)联合SonoVue微泡剂培养孔内直接辐照能否增强5-氮杂胞苷(5-azacytine,5-aza)体外诱导人骨髓间充质干细胞(HMSC-BM)的心肌样分化并初步摸索最优的超声辐照条件,为超声靶向微泡破坏(UTMD)技术在MSCs移植治疗急性心肌梗死的应用提供实验基础.方法 ①将15只健康C57BL/6雄性小鼠随机分为如下几组,组1：切脾手术+rhG-CSF皮下连续5d注射；组2：切脾手术+rhG-CSF皮下连续12 d注射；组3：空白对照组—假手术+生理盐水注射.所有动物最后1次注射后6h内剪尾采血白细胞计数和腹腔剪开腹主动脉获取外周血上流式细胞仪行CD34-CD45-CD29+CD44+MSCs含量预鉴定.②选取健康C57BL/6雄性小鼠40只,随机分为2组,即外周血MSCs培养组和骨髓MSCs培养组,前者小鼠麻醉切脾造模,2周后外周血MSCs组动物每天一次皮下注射rhG-CSF350 μg·kg-1·d-1,连续5d,后剪开腹主动脉采血并用密度梯度离心结合贴壁筛选法培养外周血MSCs,后者取小鼠股骨和胫骨骨髓用全骨髓培养贴壁法分离培养骨髓MSCs,观察两种来源的间充质干细胞形态特征及生长情况.③以不同的超声辐照强度及辐照时间于培养孔内直接超声辐照HMSC-BM,用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)筛选出对其活性无明显抑制的时间-声强组；将筛选出的超声辐照强度-时间联合不同微泡数/干细胞数比例对应的造影剂的剂量于培养孔内直接超声辐照HMSC-BM,用MTT法筛选出对其无明显抑制的微泡数/干细胞数比例.(④将HMSC-BM随机分为A、B、C、D组,各自采用如下体外心肌化诱导方式：空白对照组；5-aza组；微泡剂+超声照射组；5-aza+微泡剂+超声照射组,诱导后培养4周,倒置相差显微镜逐日观察细胞形态学变化,于诱导后28 d时免疫细胞化学染色法检测心肌特异肌钙蛋白T(cTn-T)的表达,计算并比较各组的心肌样细胞转化率.结果 ①切脾小鼠剪尾采血白细胞计数和腹主动脉剪断采血流式细胞仪分析显示动员骨髓组小鼠外周血白细胞及CD34-CD45-CD29+CD44+MSCs明显高于对照组,且注射5d高于12d组.②外周血单个核细胞未能培养出MSCs样集落,而骨髓单个核细胞则能培养出MSCs集落.③无明显抑制HMSC-BM活性且有一定空化效应的培养孔内直接超声辐照条件为辐照强度0.55W/cm2、辐照时间为30s、微泡数/干细胞数比值为50；④各组HMSC-BM诱导后免疫细胞化学染色法检测发现仅B组及D组可见cTnT表达阳性,且阳性率D组％显著高于B组(0.364±0.084 vs.0.146±0.025,P＜ 0.05).结论 ①rhG-CSF在一定时间内可以有效动员小鼠骨髓MSCs至外周血；但小鼠外周血MSCs分离培养较骨髓MSCs较难,其最大原因是在于生理条件下及动员骨髓后外周血MSCs含量极少.②0.55W/cm2的声强、30s的辐照时间、微泡数/干细胞数比为50为最优的直接孔内超声辐照条件.适当条件的低强度脉冲超声辐照能够增强5-aza体外诱导HMSC-BM的心肌样分化效果,为增强MSCs移植治疗心肌梗死疗效提供一种新的思路.