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目的我们已经报道在心肌细胞中去甲肾上腺素和肾上腺素激动beta2-肾上腺素受体(β2-AR)后,可通过GRK2磷酸化受体而介导不同的信号通路。为了进一步研究β2-AR磷酸化对受体功能的影响,我们将在体外原代培养的心肌细胞系统中进行相关的研究。方法通过体外原代培养β-AR基因敲除小鼠的心肌细胞并利用腺病毒感染过表达β2-AR;通过免疫荧光及整体细胞ELIS检测受体的内化(internalization),应用Western blotting测定受体的磷酸化状态,免疫共沉淀方法观察磷酸化受体的结合蛋白,利用体外培养心肌细胞活细胞收缩率实验对心肌细胞功能进行的检测,此外,还通过受体磷酸化位点的定点突变技术,进一步观察突变受体的功能改变。结果在过表达β2-AR的心肌细胞中,持续肾上腺素激动β2-AR受体可引起seine355/356(S355/356)快速磷酸化并具有浓度依赖性但并不导致S345/346位点的磷酸化。相应的心肌收缩率也快速增加然后缓慢降低,同时免疫荧光和整体细胞ELISA显示β2-AR受体发生明显内化。当去除激动剂60 min后,心肌细胞收缩功能基本恢复,细胞中内化的受体也基本回到细胞表面。而应用磷酸酶抑制剂OA处理后,受体重循环(recycling)受到抑制。以上结果β2-AR受体磷酸化和去磷酸化对受体内化和重循环,以及心肌细胞的收缩反应,具有十分重要作用。将β2-AR受体S355/356位点突变为丙氨酸后,受体的内化受到明显抑制,而突变β2-AR受体S345/346位点并不改变受体的内化过程,进一步表明β2-AR受体S355/356对受体内化功能的重要性,而内化的受体在S355/356位点存在磷酸化。进一步在心肌细胞中共表达β2-AR受体和beta-arrestin时,免疫荧光结果显示beta-arrestin与内化的受体共定位,免疫共沉淀结果也证明beta-arrestin与受体相结合,这些结果提示内化的S355/356磷酸化β2-AR受体可通过与beta-arrestin结合进一步介导受体的信号和功能。结论在心肌细胞中,β2-AR受体S355/356而非S345/346磷酸化及去磷酸化对受体的内化,重循环以及心肌细胞的收缩功能具有重要的影响。