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果胶酶是一类能作用于果胶质的酶的总称,在食品、饲料、环保和纺织等行业具有重要应用价值.利用微生物发酵生产是果胶酶的主要来源,具有非常重要的意义.本文通过对果胶酶产生菌的筛选、诱变,发酵条件和酶学性质的研究,以期为果胶酶的工业生产与应用提供理论依据.研究结果如下:
1、采用透明圈法初筛、液态发酵复筛,从腐烂的苹果中分离筛选获得一株产果胶酶能力较强的菌株YQ-13.结合形态学观察与ITS rDNA序列分析,鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger).对其进行紫外--氯化锂复合诱变,确定了最佳诱变剂量为紫外照射5min、诱变筛选培养基氯化锂含量0.3％.通过5轮的反复诱变,最终获得能够稳定遗传的黑曲霉YQY-36突变菌株,其果胶酶酶活力为67.6U/mL,较诱变前的19.6U/mL提高了2.44倍.
2.通过单因素实验和响应而设计，确定黑曲霉YQY-36的最佳摇瓶培养基成分为桔皮粉4.2%,葡萄糖0.5%、蛋白胨2.8%,(NH4)2SO4 1.5%,Na2HPO4·12H2O 0.17%,KH2PO4 0.14%,ZnSO4·7H2O 0.05%,pH4.0;培养条件为接种量10%、装液量70mL/250mL、于200r/min的旋转式摇床中28℃培养84h。优化后果胶酶活力最高可达132.8U/mL.
3、对黑曲霉YQY 36进行5L发酵罐小试生产研究，通过实验发现溶解氧、培养基碳氮比以及补料策略对产果胶酶能力都有显著的影响。最终确定发酵方案为:5L发酵罐初始装料3L，培养基成分为桔皮粉1.42%、蛋白胨1.40%,葡萄糖0.50%,(NH4)2SO4 0.70%、Na2HPO4·12H2O 0.17%,KH2PO4 0.14%,ZnSO4·7H20 0.05%,pH4.0，发酵起始转速650r/min,通气量200L/h，接种量10%，发酵温度28℃，发酵过程中调节转速与通气量使发酵液DO不低于30;发酵至24h后开始以40mL/h的速度进行补料，补料总量为1L:补料培养基成分为桔皮粉8.50%、蛋白胨1.80%,(NH4)2SO4 0.90%,Na2HPO4·12H2O 0.17%,KH2PO4 0.14%,ZnS04·7H2O 0.05%，pH4.0。经优化后，5L发酵罐产果胶酶的最高峰出现在60h时，酶活力为263.9U/mL，发酵周期比摇瓶发酵缩短了24h,酶活力提高了98.7%.
4、对果胶酶进行酶学性质研究，结果表明:黑曲霉YQY 36所产果胶酶最适反应pH为4.0;最适反应温度为60℃;pH稳定性良好，在pH为4.0-7.0,30℃条件下处理3h后酶活力保持在80%以上;在温度低于40℃时热稳定性较好，保温3h酶活力基本没变，当温度高于50℃后酶活力急剧下降。