【摘 要】
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目的：建立一种操作简便、经济且直观的SMN基因定量检测方法并评价其实验性能.方法：建立一种基于Sanger测序技术的相对定量检测方法：在SMN基因的同源序列处设计引物,使PCR产
【机 构】
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首都儿科研究所遗传室,北京市朝阳区雅宝路2号,100020
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目的：建立一种操作简便、经济且直观的SMN基因定量检测方法并评价其实验性能.方法：建立一种基于Sanger测序技术的相对定量检测方法：在SMN基因的同源序列处设计引物,使PCR产物涵盖4个SMN基因差异位点.由于SMN1和SMN2基因在一个PCR反应中同时扩增,因而二者可互为内对照,通过比较测序图中差异碱基峰的高度,分析SMN1和SMN2基因剂量.①含有SMN1和SMN2基因不同摩尔比例的质粒混合物模拟不同SMN基因剂量比值,用于新方法的建立.②应用新方法和MLPA技术同时检测223例临床诊断为脊肌萎缩症(SMA)的患儿和216例对照样本,并计算实验敏感度和特异度,用于新方法实验性能的评估.受试者工作特征曲线(ROC)用于反映新方法与MLPA检测结果的一致性.③对于新方法发现的SMN1杂合缺失患儿,扩增所有SMN基因编码区筛查点突变,并通过比较突变碱基与野生碱基峰高来初步判定突变是否位于SMN1基因.结果：当SMN1或SMN2基因纯合缺失、SMN1与SMN2的摩尔比例为1∶1～1∶4或4∶1时,基于Sanger测序的新方法均可准确检出.与MLPA结果相比,新方法的实验敏感度和特异度均为98.6％.ROC曲线分析显示新方法与MLPA检测结果具有高度一致性(P＜0.001；AUC=0.986).此外,本研究共发现10例SMN1杂合缺失的SMA患儿,其中9例应用该方法筛查到点突变且提示突变位于SMN1基因,并全部经T-A克隆测序得以证实.结论：本研究建立的基于Sanger测序技术的SMN相对定量检测方法,不但可以用于诊断缺失型SMA,还可用于筛查SMN1点突变.本研究提示Sanger测序除了作为检测序列变异的金标准,在某种情况下还可用于相对定量分析基因剂量的改变.
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