【摘 要】
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利用绵羊KAP6-1 启动子构建毛囊特异性表达Cre 酶(Cause recombinase)的真核表达载体,为利用Cre/LoxP系统删除目的基因提供条件.引言：Cre酶是噬菌体P1基因组中1029bp的一
【机 构】
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内蒙古大学生命科学学院,哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室呼和浩特,010021
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利用绵羊KAP6-1 启动子构建毛囊特异性表达Cre 酶(Cause recombinase)的真核表达载体,为利用Cre/LoxP系统删除目的基因提供条件.引言：Cre酶是噬菌体P1基因组中1029bp的一段DNA序列编码的蛋白质,不仅有催化活性,而且具有同限制性酶类似的能够识别特异的DNA 序列并进行特定的剪切和拼接的功能.Cre 酶能够识别LoxP 序列,当同一DNA序列中两个LoxP序列方向相同时,Cre 酶可以将两个LoxP 序列之间的序列剪切掉；当同一DNA序列中两个的LoxP 序列方向相反时,Cre 酶可以将两个LoxP 序列之间的序列颠倒；当两个LoxP 序列在不同DNA 上时,Cre 酶可以使两个DNA 片段发生重组.利用Cre 酶的这种特性,在标记基因的两侧加上同方向的两个LoxP 序列,即可将目的基因删除.材料与方法：利用PCR 技术,以pCAG-Cre-GFP 质粒为模板扩增Cre 酶基因,亚克隆到pMD19-T 载体上,得到pMD19-T-Cre 质粒.经测序正确后,EcoR I/Xba I双酶切pMD19-T-Cre和pIRES2-KAP6.1-EGFP,回收片段,连接得到pIRES2-KAP6.1-Cre-EGFP真核表达载体.结果：在pCAG-Cre-GFP载体中,Cre酶和GFP是融合表达的,故我们在设计PCR引物时在下游引物中加上了终止密码子.构建的毛囊特异性表达Cre酶的载体pIRES2-KAP6.1-Cre-EGFP经双酶切和PCR鉴定正确,测序结果表明Cre酶基因顺序连接在KAP6-1 启动子下游,IRES 序列和GFP 基因均按正确顺序连接,载体构建成功.讨论：表达载体pIRES2-KAP6.1-Cre-EGFP 可以在毛囊细胞中特异性表达Cre 酶,进而利用Cre/LoxP系统在毛囊细胞中条件性删除阻遏毛囊生长周期的调控基因,促进毛囊发育及延长生长期,培育高转基因动物的产绒量.
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