【摘 要】
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目的：确证在ATRA诱导白血病细胞分化过程中CDK2依赖于泛素-蛋白酶体途径(UPP)发生降解这一全新的CDK2调控方式，并探讨这种降解与ATRA诱导白血病细胞分化之间的关系。方法：CD11b-PE抗体标记细胞，采用流式细胞术检测NB4细胞的分化率；细胞计数并绘制生长曲线观察细胞生长情况；NBT还原实验检测NB4细胞分化情况；荧光定量PCR检测NB4细胞中CDK2 mRNA水平的变化；免疫荧光法观
【机 构】
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浙江大学药学院药理毒理与生化药学研究所 浙江 杭州 310058
【出 处】
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2011医学科学前沿论坛暨第12届全国肿瘤药理与化疗学术会议
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目的：确证在ATRA诱导白血病细胞分化过程中CDK2依赖于泛素-蛋白酶体途径(UPP)发生降解这一全新的CDK2调控方式，并探讨这种降解与ATRA诱导白血病细胞分化之间的关系。方法：CD11b-PE抗体标记细胞，采用流式细胞术检测NB4细胞的分化率；细胞计数并绘制生长曲线观察细胞生长情况；NBT还原实验检测NB4细胞分化情况；荧光定量PCR检测NB4细胞中CDK2 mRNA水平的变化；免疫荧光法观察NB4细胞内CDK2与Ub蛋白的共定位情况；采用脂质体转染法在COS7载体细胞中分别或共同转染CDK2及Ub质粒；在经核酸酶处理的兔网织红细胞裂解液(RRL)中体外表达CDK2重组蛋白；Western Blot法检测NB4和COS7细胞中CDK2、Ub及其它相关蛋白的表达情况；免疫沉淀法结合Western Blot分析CDK2的泛素化降解情况；采用慢病毒转染法在NB4细胞中转染CDK2 shRNA质粒沉默CDK2蛋白。结果：(1)随ATRA诱导NB4细胞分化率的增加，CDK2表达水平逐渐下降；ATRA合用蛋白酶体抑制剂MG132后．CDK2蛋白的下调被显著逆转，而CDK2的mRNA水平在MG132作用前后并无明显变化，为进一步排除转录水平调控对CDK2蛋白含量的影响，以亚胺环己酮(CHX)抑制蛋白合成后，ATRA仍能引起CDK2下调，同时ATRA的这一作用能够被MG132所逆转．以上结果提示在ATRA诱导NB4细胞分化过程中，蛋白酶体依赖的降解可能参与了CDK2蛋白的调控．(2)以ATRA处理NB4细胞，免疫荧光检测发现CDK2蛋白的荧光强度随时间延长呈下降趋势，而CDK2蛋白与Ub蛋白两者的荧光共定位点则逐渐增多：免疫沉淀结果显示ATRA单独作用1天后，CDK2与Ub蛋白的相互作用达到最大程度，随后CDK2明显下调，与其结合的Ub随之减少，而合用Mg132则可明显减慢二者结合水平的下降；表明ATRA可促进NB4细胞中CDK2的泛素化而使其通过蛋白酶体途径发生降解．(3)在COS7载体细胞中转染CDK2质粒，同时转入载体质粒或Ub质粒，发现外源性CDK2可与外源性Ub蛋白结合，且外源性CDK2蛋白因Ub的表达增加而下调；采用MG132处理则可显著逆转Ub表达增加引起的CDK2的下降，同时上调CDK2与Ub的结合水平．(4)从高表达CDK2的CO57细胞当中免疫沉淀获得CDK2蛋白-抗体复合物，使之在未处理的RRL体系中反应一段时间，可明显观察到CDK2蛋白的泛素化；同样体外表达的CDK2重组蛋白在耒处理的RRL体系中反应后也发生明显的泛素化，且随反应时间延长CDK2逐渐降解，从而在体外环境中进—步确证了UPP依赖性的CDK2的降解方式．(5)为检测CDK2的泛素化降解在ATRA诱导NB4细胞分化过程中的作用，在NB4细胞中转染CDK2 shRNA质粒下调CDK2蛋白，生长曲线、NBT还原实验及CDllb表达率检测的结果显示，CDK2表达水平的降低可显著增强ATRA诱导NB4细胞分化的能力．结论：ATRA作用于NB4细胞可引起CDK2蛋白发生泛素化并通过蛋白酶体途径降解，且CDK2的下调可显著促进ATRA诱导的白血病细胞的分化．
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