论文部分内容阅读
目的：探讨体外诱导人羊膜间充质细胞向子宫内膜上皮细胞分化的可行性和安全性分析。
方法：回归性分析郑大三附院妇产科因不明原因不孕行诊断性刮宫患者的子宫内膜组织，经病理学检查为正常增生期子宫内膜。所取标本经患者知情同意。①无菌条件下刮取子宫内膜，PBS冲洗组织3次，剪碎约1mm3，加人两倍量0.25％胶原酶溶液,37℃水浴箱中震荡消化40min，加人含血清的培养基终止消化。②将消化的组织先经200目细胞筛网，滤去大块组织碎片，再经400目筛网，所得滤液中主要为子宫内膜基质细胞;将滤液500r/min离心3min，取上清;1200r/min离心10min，弃上清，底部为纯化的基质细胞。③将离心后的基质细胞加人含有10%FBS的DMEM-F12培养液，以1×106/ml接种于25 cm2细胞培养瓶，置37℃,5%CO2仇培养箱中培养。④细胞接种后2h,将悬浮的红细胞及上皮细胞团吸出，加人新的培养液。
结果：1.hAMCs的形态学特征及鉴定，分离提纯的hAMCs传代后生长较快，6h基本完全贴壁，培养24h后细胞增殖明显，细胞数量明显增多。贴壁生长的人羊膜间充质细胞呈现长梭形，细胞质均匀透亮，为典型的成纤维细胞形态。4-5天细胞基本铺满瓶底，成漩涡样生长。细胞免疫组化染色鉴定显示hAMCs表达间质细胞特异性蛋白波形蛋白，不表达上皮细胞特异性角蛋白;免疫荧光染色结果提示hAMCs胞浆中有荧光表达，表说明hAMCs表达胚胎干细胞表面标记蛋白OCT-3/4;流式细胞仪检测hAMCs表达干细胞表面分子CD29。2.ESCs的形态特征及鉴定，子宫内膜细胞体外原代培养12h后即开始贴壁，培养24h后，细胞出现明显增殖。贴壁生长的原代子宫内膜细胞呈现类成纤维细胞形态。细胞伸直、拉长，细胞核卵圆形，细胞呈现中间稍宽，两端尖的纺锤形。对培养的第3代细胞进行基质细胞特异的波形蛋白免疫组织化学染色，阳性细胞胞质呈棕黄色，证实培养的细胞为子宫内膜基质细胞。3.hAMCs诱导分化后的形态特征及鉴定，用加人诱导剂培养液培养的hAMCs，在诱导的第5天于倒置显微镜下观察，部分细胞仍呈细长梭形，细胞体积较小，部分细胞体积增大，成扁平不规则多角形，胞浆丰富，细胞质比例明显增大。表明诱导组部分细胞形态向上皮细胞方向变化。细胞免疫化学染色结果显示诱导组角蛋白表达呈阳性，对照组细胞角蛋白表达阴性;实时荧光定量PCR检测诱导组细胞CK19 mRNA相对表达量为5.31±0.92，对照组为1.00，实验组含量较对照组含量高，差异有统计学意义(P<0.05)。
结论：本实验初步研究了hAMCs在子宫内膜细胞培养液、雌激素及生长因子的作用下，有向子宫内膜上皮细胞的分化的潜能，为干细胞移植人宫腔修复损伤的子宫内膜提供了新的思路和研究方向。