【摘 要】
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目的 构建基于PiggyBac转座子的无病毒参与的肝细胞永生化载体,并在HL-7702细胞中初步应用及验证,为进一步构建新型人源性永生化肝细胞株提供实验基础.方法 通过Gateway重组克隆技术BR反应和LR反应,以及酶切连接,构建基于PiggyBac的肝细胞永生化载体PB hTERT/E2A/eGFP/F2A/neo;将永生化载体与辅助载体pCAGG-PBase共转染HL-7702细胞,药物筛选
【机 构】
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广州市第一人民医院消化内科 南方医科大学南方医院消化内科
【出 处】
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中华医学会第十六次全国病毒性肝炎及肝病学术会议
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目的 构建基于PiggyBac转座子的无病毒参与的肝细胞永生化载体,并在HL-7702细胞中初步应用及验证,为进一步构建新型人源性永生化肝细胞株提供实验基础.方法 通过Gateway重组克隆技术BR反应和LR反应,以及酶切连接,构建基于PiggyBac的肝细胞永生化载体PB hTERT/E2A/eGFP/F2A/neo;将永生化载体与辅助载体pCAGG-PBase共转染HL-7702细胞,药物筛选构建稳转细胞株;利用CCK8和流式细胞术对其增殖能力及细胞周期进行检测,利用qRT-PCR技术、免疫细胞化学技术等对其肝细胞功能水平进行检测.结果 PCR酶切和测序鉴定均证实成功构建了肝细胞永生化载体PBhTERT/E2A/eGFP/F2A/neo,与辅助载体共转染HL-7702细胞后,hTERT基因在肝细胞内转录和表达均明显升高,细胞增殖能力有了明显的提高(P＜0.05),肝细胞功能基因的转录在转染前后无明显改变(P＞0.05),细胞化学检测P450及白蛋白等肝脏功能蛋白的表达水平在转染前后亦无明显改变.结论 本研究建立了一种基于高转座活性DNA转座子的肝细胞永生化载体,主要优势在于无病毒载体的参与.
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