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目的本实验目的在于探讨人外周血单个核细胞在体外分化成血管样细胞的潜能,包括血管内皮祖细胞和血管平滑肌样细胞。方法抽取人股动脉抗凝血10-15ml用Ficoll密度梯度离心法分离得到单个核细胞(MNC)分别为M-199和EBM-2培养基培养在包被有2%明胶的六孔板中。其中EPCs培养基为M—199,刺激因子为牛垂体提取物。SPCs培养基为EBM-2,刺激因子为血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)。对EPCs的鉴定包括以下内容:对培养第7天的细胞进行细胞摄取DiI-Ac-LDL实验,14天进行CD31、CD34、Flk-1、vWF的免疫荧光和免疫组化鉴定以及(2D31、CD34的流式细胞计数,同时用RT-PCR的方法检测细胞是否含有ecNOS、Flk-1、Flt-1、tie-2等基因。对平滑肌细胞的鉴定包括以下内容:平滑肌细胞α-ac-tin(αSMA)、肌球蛋白重链、calponin的免疫组化鉴定。结果每ml外周血经Ficoll密度梯度离心可行到MNC 1-2×106。用M-199和牛垂体提取物培养的细胞呈贴壁生长,梭形多见,常有成簇生长、条索状或管状分布的形态特性。这些贴壁细胞在第7天发现约85%有摄取DiI-Ac-LDL现象;第14天的免疫荧光和免疫组化检测中发现多数贴壁细胞胞浆内含有CD31、CD34、Flk-1、vWF;同时流式细胞数检测结果显示CD31为(70.24±10.12)%(n=5),CD34为(55.37±14.85)%(n=8);RT-PCR检测结果显示细胞表达内皮细胞特异性基因ecNOS、Flk-1、Flt-1、tie-2。用EBM-2和PDGF-BB培养的细胞也呈贴壁生长,长梭形多见,具有典型的谷峰样生长的形态特性。免疫组化结果提示所培养的细胞胞浆aSMA、肌球蛋白重链、calponin均阳性。结论由于用M-199和牛垂体提取物培养的细胞具备了干细胞的特性,可认定这些细胞为EPCs。用EMB-2和PDGF-BB培养的细胞具备了平滑肌细胞的特性。因此从外周血MNC在体外分化成血管样细胞是可行的。