【摘 要】
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目的：本研究旨在通过体内外实验探讨了JNK信号通路在鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)向雄性生殖细胞分化过程中的作用.方法：利用前期转录取测序筛选出JNK信号通路中的关键信号分子MAPK8,构建其干扰及过表达载体,并检测其活性;取培养至2代的雄性ESCs,在RA诱导的基础上干扰或过表达MAPK8,分别收集体外诱导4d及10d的细胞样品,通过QRT-PCR、间接免疫荧
【机 构】
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扬州大学动物科学技术学院 江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室,江苏扬州 225009
【出 处】
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江苏省畜牧兽医学会2017年学术年会
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目的：本研究旨在通过体内外实验探讨了JNK信号通路在鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)向雄性生殖细胞分化过程中的作用.
方法：利用前期转录取测序筛选出JNK信号通路中的关键信号分子MAPK8,构建其干扰及过表达载体,并检测其活性;取培养至2代的雄性ESCs,在RA诱导的基础上干扰或过表达MAPK8,分别收集体外诱导4d及10d的细胞样品,通过QRT-PCR、间接免疫荧光、流式分析等方法对生殖细胞特异表达的基因及蛋白表达水平进行检测;取刚受精的新鲜鸡胚,血管注射MAPK8干扰载体和过表达载体,正常孵化,分别收集鸡胚体内发育4.5d的生殖嵴样本和18d睾丸样本,并通过QRT-PCR、Western Blot等方法对生殖细胞特异表达的基因及蛋白表达水平进行检测。
结果：体外诱导实验发现:干扰组的ESC在诱导4d后产生的类PGCs样细胞数量及10d后产生的精原样生殖细胞数量均显著的低于RA诱导组;qRT-PCR结果显示RA诱导过程中生殖标记基因integrinα6,integrinβ1持续上调表达,而sh-MAPK8组的生殖标记基因表达水平未发生显著变化;间接免疫荧光结果和流式细胞分选也表明:过表达组第4d的CVH阳性细胞及第10d产生的integrinα6阳性细胞数目显著高于对照组和干扰组.在体内试验中干扰组载体能够在鸡胚中稳定表达,且能够显著下调MAPK8基因的表达,且影响睾丸发育,而第4d PAS结果亦显示干扰组的PGCs数量显著低于正常孵化组;荧光定量实验结果也表明:在体内情况下抑制MAPK8基因的表达,能够显著的抑制CVH,Ckit,integrinα6,integrinβ1基因的表达。
结论：JNK信号通路参与调控鸡ESCs向雄性生殖细胞分化的过程,本文为初步构建鸡雄性生殖细胞分化的调控网络,揭示生殖细胞形成机制提供实验基础.
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