【摘 要】
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[目的]提高原核生物来源D-氨基酸氧化酶的催化活性.[方法]根据同原序列比对确定待突变位点,以原玻璃蝇节杆菌中D-氨基酸氧化酶基因的原核表达载体pET-DAAO32为模板,采用Q
【机 构】
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河北师范大学生命科学学院,石家庄 050024
【出 处】
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2015中国酶工程与糖生物工程学术研讨会
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[目的]提高原核生物来源D-氨基酸氧化酶的催化活性.[方法]根据同原序列比对确定待突变位点,以原玻璃蝇节杆菌中D-氨基酸氧化酶基因的原核表达载体pET-DAAO32为模板,采用QuickChange Site-Directed Mutagenesis技术构建定点突变体.经过原核表达及纯化获得重组型和突变体酶蛋白,分析其酶学特性.[结果]实验成功构建获得了18个突变体.酶学特性测定表明,野生型DAAO32和突变体酶蛋白都具有较广泛的底物特异性,最适反应温度均为30℃；DAAO32和突变体T286A的最适反应pH范围为7.0-11.0,其他突变体酶蛋白的最适反应pH范围为8.0-11.0；除突变体T256K的最适底物为D-Phe外,其余酶蛋白的最适底物均为D-Met；动力学参数测定发现,以二级表观常数表示,对于底物D-Met或D-Phe,三点突变体E115A/N119D/T286A的二级表观常数kcat/Km是野生型DAAO32的5.1倍,是猪肾来源的pKDAAO(Sigma产品)的56倍.[结论]通过定点突变技术所构建的三点突变体E115A/N119D/T286A具有较高的催化效率,具有较好的应用前景.
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