【摘 要】
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目的 研究透明质酸(HA)配接激活CD44对人肝癌细胞株干性的影响.并探究丙酮酸激酶2型(PKM2)在该信号通路中起到的作用及其激活机制.方法 以人肝癌细胞株(MHCC97H,HepG2)为靶细胞.用HA处理细胞,比较HA激活CD44对肝癌细胞特性的影响.构建PKM2慢病毒敲出细胞,验证PKM2在HA-CD44信号通路中起到的作用.构建PKM2磷酸化位点突变质粒,验证PKM2在通路中发挥作用的机制
【机 构】
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复旦大学附属中山医院 200032
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目的 研究透明质酸(HA)配接激活CD44对人肝癌细胞株干性的影响.并探究丙酮酸激酶2型(PKM2)在该信号通路中起到的作用及其激活机制.方法 以人肝癌细胞株(MHCC97H,HepG2)为靶细胞.用HA处理细胞,比较HA激活CD44对肝癌细胞特性的影响.构建PKM2慢病毒敲出细胞,验证PKM2在HA-CD44信号通路中起到的作用.构建PKM2磷酸化位点突变质粒,验证PKM2在通路中发挥作用的机制.用cck8方法检测细胞对5氟脲嘧啶(5-Fu)及奥沙利铂(OX)耐受性；用平板克隆实验及裸鼠皮下成瘤实验评价肝癌细胞干性.应用免疫荧光检测PKM2亚细胞定位,并提取核内蛋白用Western blot的方法进一步验证.结果 (1) MHCC97H中,HA组5-Fu及OX耐药性分别是对照组的126.47％±3.92％、152.87％±8.32％；HepG2中分别是109.21％±1.73％、 124.30％±8.05％.HA组与对照组平板克隆形成数(个/1000细胞)分别为：MHCC97H,86.67±4.05,62.33±3.93；HepG2,141.71±2.27,121.01±4.16.提示HA促进肝癌细胞株耐药及克隆形成.(2) MHCC97H中,PKM2敲出组、HA处理敲出组、空载体对照组的5-Fu耐药性分别是对照组的74.80％±2.63％、71.77％±1.76％、97.39％±3.22％；OX耐药性分别是对照组的80.54％±2.31％、80.39％±2.64％、88.44％±3.26％.PKM2敲出组、HA处理敲出组、空载体对照组及野生株组平板克隆形成数(个/1000细胞)分别为37.00±3.05,38.33±3.93,58.67±2.33,61.33±4.46.PKM2敲出组及对照组4周皮下成瘤体积分别1.17±0.12cm3,1.89±0.18cm3.HepG2中结果相似.提示PKM2分子在HA-CD44通路中起到重要作用.(3)两株细胞中PKM2主要存在胞浆中,HA作用均引起该分子核转位,应用CD44阻断抗体可阻断转位效应.MHCC97H中,PKM2磷酸化位点突变组、PKM2过表达组及空质粒对照组的5-Fu耐药性分别是对照组(PKM2敲出组)的87.51％±4.38％、109.48％±3.97％、 89.57％±5.83％；OX耐药性分别是对照组的91.07％±4.18％、114.91％±4.40％、97.27％±5.67％.提示PKM2以核转位的形式介导HA-CD44信号.结论 HA激活CD44促进入肝癌细胞株耐药及克隆形成能力,且PKM2核转位是该通路中重要的一环.
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