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2013年我国吉林某养鸡场发生疑似H9亚型禽流感疫情,采集该发病鸡场病料接种9日龄SPF鸡胚,分离得到一株病毒.分离毒株具有鸡红细胞凝集性,将有血凝活性的病毒液分别与ND、EDS、AIV H5、AIV H7和AIV H9标准阳性单因子血清进行血凝抑制试验,结果显示,分离的病毒凝集鸡红细胞的特性能被H9亚型禽流感阳性单因子血清所抑制,而不能被其他阳性单因子血清所抑制,则初步判定分离毒株为H9亚型禽流感.本研究然后对分离株的HA基因进行测序鉴定,登陆NCBI将分离毒株HA基因序列进行Blast在线比对,结果显示该基因序列与国内H9N2分离株A/Chicken[Rizhao/811/2013(KF259172.1)相似性最高(达gg％),为2013年的流行毒株,最终验证该分离株为H9亚型禽流感病毒.
本研究接着对分离株的HA基因进行了分析.其氨基酸序列分析显示,分离株HA蛋白裂解位点为RSSRIGLF,没有多个连续的碱性氨基酸插入,具有典型的低致病性禽流感病毒的分子特征.分离株HA肽链具有9个潜在糖基化位点,分别位于氨基酸残基的29-NSP、82-NPS、141-NNS、218-NRT、298-NTT、305-NNS、313-NCS、492-NGT、551-NGS,与近些年H9亚型AIV分离株的潜在糖基化位点相同,同时也具有近几年新出现的313位的NCS潜在糖基化位点.分离株HA肽链的8个受体结合位点分别位于109aa (Y)、16laa (W)、163aa (T)、19laa (N)、198aa(A)、202aa (L)、203aa (Y)、234aa (T),而HA受体结合位点的特异性决定病毒感染的宿主范围,在病毒适应新的宿主时,234位受体结合位点的氨基酸通常会发生变化,本研究分离株HA基因的234位受体结合位点由Q(谷氨酰胺)变异成T(苏氨酸),该毒株存在适应新宿主的可能性,但是否能适应新的宿主还有待进一步研究.本研究用MEGA5.2软件对分离株和GenBank中21株AIV H9N2参考毒株进行HA基因遗传进化分析,结果显示分离株位于以A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)、A/Quail/Hong Kong/GI/97 (H9N2)为代表的欧亚进化分支,但与中国最早分离株A/Chicken/Beijing/l/94(H9N2)分别形成独立的亚分支,表现亲缘关系较远,与2007年之前我国H9亚型AIV主要流行分支的代表毒株A/Duck/Hong Kong/Y280/97(H9N2)亲缘关系亦较远,与2007年后我国H9亚型AIV主要流行分支的代表株A/Chicken/Guangxi/5 5/2005(H9N2)亲缘关系较近,而与2013年分离株A/Chicken/Rizhao/811/2013(H9N2)亲缘关系最近.
本研究最后对分离毒株的致病力和免疫原性进行了初步研究.致病力试验结果显示,分离毒株对鸡胚的毒力较强,接胚96小时后死亡胚总数占接胚数90％( 18/20),病毒对鸡胚的致死时间主要集中在48 - 72小时之间,死亡与存活的胚体均有明显的出血点;然而分离毒株对SPF雏鸡的毒力表现较弱,静脉攻毒鸡在攻毒后10天内未出现发病与死亡,其原因可能是临床上的H9发病后多并发有其它病毒、细菌,从而加重鸡群病情、使鸡群出现临床症状或是患病鸡的死亡,而本试验攻毒的是SPF雏鸡,在实验室负压隔离器内饲养,饲养环境纯净、动物自身体内也不含有其它致病毒菌,也就不存在其他致病菌与H9病毒相互协同致病导致病情加重的可能性,因而本试验鸡在攻毒后未表现发病与死亡.将分离毒制备成油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡,免后第21天,鸡体内产生了较高的HI抗体,其平均值高达10.2log2,试验结果表明分离毒株具有很好的免疫原性.