【摘 要】
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1引言Importin β1蛋白属于核质转运受体蛋白importin β家族成员之一,它是一种相对保守的、广泛分布于真核生物细胞内的核转运受体蛋白.早期的研究证实靶蛋白入核转运需要importin o和importinβ蛋白的共同参与,但是近年来的研究发现importin β1可直接介导靶蛋白的入核转运.本课题组前期通过荧光共定位试验发现鸡importinβ1蛋白参与了新城疫病毒(NDV)M蛋白的
【机 构】
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贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025 贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学高
【出 处】
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中国畜牧兽医学会家禽学分会第十八次全国家禽学术讨论会
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1引言Importin β1蛋白属于核质转运受体蛋白importin β家族成员之一,它是一种相对保守的、广泛分布于真核生物细胞内的核转运受体蛋白.早期的研究证实靶蛋白入核转运需要importin o和importinβ蛋白的共同参与,但是近年来的研究发现importin β1可直接介导靶蛋白的入核转运.本课题组前期通过荧光共定位试验发现鸡importinβ1蛋白参与了新城疫病毒(NDV)M蛋白的入核转运,但两者之间是否存在直接的相互作用还需进一步验证.本研究构建鸡importin β1蛋白的原核表达载体pET-32a-importinβl,对鸡importin β1蛋白的最佳表达条件进行摸索,旨在为后续研究importin β1蛋白与NDV M蛋白的相互作用奠定基础.2材料与方法从鸡胚成纤维细胞传代细胞系DF-1中提取总RNA,反转录合成cDNA.用扩增鸡importin β1基因CDS区特异性引物进行PCR扩增.将目的基因克隆至pCR2.1载体,酶切鉴定正确后测序,将阳性克隆质粒和原核表达载体pET-32a分别进行双酶切,胶回收后连接转化DH5a感受态细胞.挑取单菌落扩大培养,将菌液PCR和双酶切鉴定均正确的重组载体送公司测序,获得的阳性重组载体转化BL21(DE3)感受态细胞,通过摸索IPTG浓度、诱导温度和诱导时间来确定鸡importin β1蛋白的最佳表达条件.3结果经菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和DNA测序,成功构建重组原核表达载体pET-32a-importin β1.将pET-32a-importin β1转化至BL21(DE3)菌株进行诱导表达,摸索不同诱导表达条件,最终确定当IPTG终浓度为0.1 mM、诱导温度为37 ℃、诱导时间为5h时,SDS-PAGE鉴定的重组蛋白His-importin β1的表达量最高,但重组蛋白主要以包涵体形式存在.4讨论本研究成功构建了鸡importin β1蛋白的重组原核表达载体pET-32a-importin β1,转化至宿主菌后获得的目的蛋白分子量与预测蛋白分子量一致,约为84.15 kDa.研究表明蛋白分子通常含硫氨酸越多,越容易形成包涵体.对鸡importin β1蛋白的氨基酸组成分析发现该蛋白硫氨酸含量较少(蛋氨酸为3.3％、半胱氨酸为2.8％),但原核表达结果显示重组蛋白主要以包涵体形式存在,可能是由于鸡importin β1蛋白分子量较大、蛋白高效表达未能及时进行折叠修饰等原因造成.后续试验我们将对目的蛋白进行纯化并利用蛋白质复性试剂盒进行复性,采用pull-down技术验证鸡importin β1蛋白与NDV M蛋白的相互作用.
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