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7-羟基紫杉烷,如10-去乙酰基紫杉醇(DT)可被用于化学半合成著名的抗肿瘤药物—紫杉醇.前者可以由7-木糖紫杉烷水解获得,而7-木糖紫杉烷作为紫杉醇提取时的副产物普遍存在于红豆杉中且含量丰富,例如,7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇(XDT)在树皮中的含量可以达到干重的0.5％,远高于紫杉醇(大约0.02％)的含量.7-木糖紫杉烷一般作为废弃物处理,既污染环境又造成资源极大浪费,但转变成7-羟基紫杉烷则可用作半合成紫杉醇的原料.我国已有多家企业实现大面积栽培红豆杉,对保护红豆杉野生资源和缓解紫杉醇供求矛盾发挥了重要作用,但同样面临如何有效利用7-木糖紫杉烷的问题.生物法水解去除7-木糖紫杉烷的木糖基具有专一性强、环境友好等优点,但目前面临的普遍问题是由于微生物的酶量偏低等因素,导致筛选获得的菌株转化效率低下,尚达不到工业化大规模应用的要求.之前,本实验室从一株能专一性水解7-木糖紫杉烷的真菌M95.33中克隆到2个开放阅读框(ORF)序列一致性大于97％相关的酶基因(Lxy1-p 1-1和Lxy1-p1-2),并在毕赤酵母中实现非分泌型表达.其中Lxy1-p-1-2编码产物(LXYL-P-1-2)的酶活性显著高于Lxy1-p1-1的编码产物(LXYL-P-1-1),这两个重组糖基水解酶皆为双功能的β-木糖苷酶/α-葡萄糖苷酶,若从该酶的任一端去除70多个氨基酸残基之后,酶活性即完全丧失.本次报告后续研究进展.在酶学研究方面,首先根据生物信息学工具软件预测了LXYL-P-1-2上可能的底物结合位点、催化位点以及糖基化位点,并通过对可能的底物结合位点和催化位点的关键氨基酸残基进行了定点突变,证明了这些氨基酸残基对于维持酶活性的重要性.同时,对纯化得到的酶蛋白进行了稳定性测定,确定了温度、保存时间、pH等几种环境条件对保持酶活性的影响.还对重组菌进行了催化潜能的观察,发现在较为合适的条件下,重组菌转化XDT为DT的产量可以达到8.42g/L,是已知用微生物直接转化能力的十几到几十倍.在摇瓶发酵的基础上,还利用全自动生物反应器进行了重组菌发酵的中试放大初步研究,为实现进一步产业化积累了经验.